冬瓜離體再生體系的建立

李志芳 閆晉強 韓向峰 謝大森 劉文睿 伍倩慧 江 彪*

（1 佛山市農業科學研究所，廣東佛山 528145；2 廣東省農業科學院蔬菜研究所，廣東廣州 510640）

冬瓜（Benincasa hispidaCogn.，2n=2x=24）是葫蘆科冬瓜屬一年生植物，廣泛分布于亞洲的熱帶、亞熱帶和溫帶地區，在我國栽培歷史悠久，是全國性重要蔬菜（謝大森 等，2020）。其營養豐富，富含多種維生素及膳食纖維，兼具藥用和保健功效，是健康的高鉀低鈉食品（張斌 等，2009）。由于耐貯運性好、貨架期長，冬瓜已成為現代農產品加工的理想原料和調節市場均衡供應的主要蔬菜品種。

植物組織培養技術是一種非常重要的生物技術，在植物脫毒快繁、育種、資源保存以及遺傳轉化方面有著非常重要的理論和實踐意義（閆釗，2015）。近些年來，我國在西瓜、黃瓜和甜瓜等不同瓜類作物中分別利用子葉、子葉節、下胚軸、真葉等進行了相關研究，獲得了再生植株，構建了高效的再生體系（白婧 等，2008）。目前，基于植物遺傳轉化的基因功能研究高度依賴于高效的植物再生體系。雖然冬瓜的基礎研究起步較晚，但也已完成了一些重要農藝性狀，如果皮顏色（Jiang et al.，2015）和果實相關性狀（Liu et al.，2018）的基因定位工作。隨著生物技術的快速發展和冬瓜參考基因組的發布（Xie et al.，2019），將會大力推進冬瓜基因功能研究。因此，構建高效的冬瓜遺傳轉化體系有著重要的實踐意義。

目前國內外關于冬瓜再生的研究報道相對較少，只有趙芹等（2012）利用冬瓜子葉節為外植體，初步建立了冬瓜離體再生體系。但該體系存在著不定芽分化率低、不定芽不易伸長及分化畸形芽等問題，影響了現代生物技術的遺傳轉化在冬瓜上的應用。本試驗以冬瓜子葉節為試材，通過不同激素配比研究篩選了愈傷誘導分化不定芽的培養基和芽增殖培養基等，建立了完整的組培再生體系，為冬瓜的遺傳轉化等研究提供了重要參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用冬瓜材料P131（粉皮冬瓜，單瓜質量約2.5 kg）由廣東省農業科學院蔬菜研究所提供。

1.2 試驗方法

試驗于2019 年在佛山市農業科學研究所開展。組培培養條件為溫度（25 ± 2）℃，光照時間14 h，相對濕度70%，光照2 000 lx 左右。

1.2.1 無菌苗的培養 選取飽滿光滑的冬瓜種子120 粒，將種子浸入水中6 h 后，分別用75%酒精消毒40 s 和0.1%升汞消毒10 min，用自來水清洗4 次后將種子用紗布包住放入3 瓶已滅菌且裝有濕紗布的瓶中，放入人工氣候箱BIC-250，于32 ℃催芽2～3 d，待種子出芽后轉入MS 培養基中。

1.2.2 外植體的處理方法 待子葉長出后，取下胚軸直立、子葉脫離種殼未張開的無菌苗，切去上部2/3 子葉和1 mm 側邊緣，保留1/3 子葉和2 mm 下胚軸的子葉節作為轉化外植體。下胚軸縱切將子葉節均勻分成2 片，在靠近子葉節節點處用刀輕輕造成密集傷口。

1.2.3 愈傷組織的誘導及不定芽的分化 將處理后的外植體平鋪于不同激素配比組合的1～9 號誘導培養基中，試驗設計按照正交試驗表L9（34）要求配制培養基（表1），觀察不同激素配比和暗培養天數對子葉節愈傷誘導及不定芽分化的影響。每個處理接6 瓶，3 次重復，每瓶接4 個子葉節材料，培養3～4 周后統計子葉上愈傷組織及不定芽誘導的效率。

表1 L9（34）正交試驗因素水平表

1.2.4 再生芽的繼代擴繁 切取誘導長出的再生芽，接入不同增殖培養基（MS+6-BA 0.1 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1）、（MS+6-BA 0.2 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1）和（MS+6-BA 0.4 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1）上進行繼代擴繁，每處理接5瓶，3 次重復，每瓶接12 株，培養15 d 后調查其分化芽的比例及芽生長情況，增殖系數按照每個處理子葉節分化出的全部芽體數/全部的子葉節數計算。

1.2.5 再生苗的生根培養 將生長20 d 左右的不定芽切取約2 cm 高的莖尖，接種于生根培養基1/2MS+NAA 0.2 mg·L-1中誘導生根，培養10～15 d 后調查生根情況。

1.2.6 再生植株的馴化與移栽 再生苗長到2.5～3.0 cm 高時移入馴化棚，閉瓶煉苗2～3 d，然后將瓶蓋打開繼續煉苗1～2 d。隨后將植株從瓶內取出，洗凈根部粘著的培養基，在40%多菌靈可濕性粉劑1 000 倍液中消毒浸泡3～5 min，移栽至已滅菌的育苗土中。精細管理30 d 后，待植株長到8～10 cm 即可移入大田正常生長，30 d 后調查其馴化成活情況。

2 結果與分析

2.1 不同誘導培養基對不定芽分化的影響

子葉節在誘導培養基上培養3～4 周后長出不定芽（圖1-A）。由表2 可見，9 個處理組合中處理8 和處理4 誘導出芽較多，誘導出芽率分別為41.000%和36.000%。由極差比較可知，暗培養天數和2，4-D 濃度為影響誘導不定芽再生的主要因子，其主次關系為暗培養天數＞2，4-D ＞IBA ＞6-BA；均值分析發現，暗培養天數中均值3 ＞均值1 ＞均值2，由此推斷暗培養7 d 為最優水平；2，4-D 濃度中均值2 ＞均值3 ＞均值1，由此推斷2，4-D 濃度0.1 mg·L-1為最優水平；同理確定IBA濃度0.10 mg·L-1為最優水平；6-BA 濃度0.8 mg ·L-1為最優水平；因此最佳組合配比為MS+2，4-D 0.1 mg·L-1+IBA 0.10 mg·L-1+6-BA 0.8 mg·L-1暗培養7 d。雖然處理4 和處理8 誘導出芽率較高，但整體上誘導出芽率偏低，需要適當微調做進一步篩選。

在誘導愈傷過程中，隨著2，4-D 和IBA 含量的增加，愈傷組織量也相應增加，且從處理5 開始愈傷組織表現出由緊密向疏松轉變的趨勢，愈傷組織上開始長根（表3）。

表2 不同誘導培養基對不定芽分化的影響

2.2 不同增殖培養基對冬瓜再生芽繼代擴繁的影響

由表4 可見，MS+NAA 0.05 mg·L-1+6-BA 0.2 mg·L-1的培養基中冬瓜再生芽平均增殖系數為2.487，多數芽基部有少量根長出，愈傷組織較少，芽簇生，生長健壯（圖1-B），平均高度1.8 cm；而MS+NAA 0.05 mg·L-1+6-BA 0.1 mg·L-1培養基中的冬瓜再生芽平均增殖系數為1.610，多數芽長1～2 條根，材料基部約有直徑1 cm 大小的愈傷塊，植株無簇生芽，平均高度約3 cm；MS+NAA 0.05 mg·L-1+6-BA 0.4 mg·L-1培養基中的冬瓜再生芽平均增殖系數為2.327，芽多長在基部呈簇狀，長勢弱，有的芽葉片薄甚至不成形。綜合總體長勢和芽的健壯情況，認為MS+NAA 0.05 mg·L-1+6-BA 0.2 mg·L-1的培養基為優選繼代擴繁培養基。

表3 子葉節在不同誘導培養基上的再生表現

表4 不同增殖培養基對冬瓜再生芽繼代的影響

2.3 再生苗的生根培養

將高度約2 cm、有2 片葉展開的無菌苗，接種到生根培養基1/2MS+NAA 0.2 mg·L-1上，培養5 d 左右植株基部開始出現白色突起的根原基，葉片嫩綠長勢健壯，15 d 后苗高約4 cm 左右，生根率為100%，每株根條數為4 條左右（圖1-C）。

2.4 再生植株的馴化與移栽

將生根苗移入馴化棚，移栽之前不能打開瓶蓋，讓瓶苗逐步適應棚內環境，逐步加強光照，光照強度控制在3 000～5 000 lx，3～5 d 后根系長到3 cm 以上，并且有新葉長出時可以開瓶移栽。

移栽前先將0～5 mm 的泥炭土粉碎，再用40%多菌靈可濕性粉劑500 倍液對泥炭土進行消毒，然后將消毒好的泥炭土裝入32 孔穴盤備用；移栽時打開瓶蓋，將組培苗輕輕拔出放入40%多菌靈可濕性粉劑1 000 倍液中浸泡3～5 min 消毒，然后撈出栽到穴盤中，澆透水。將穴盤放到床架上進行組培苗馴化，30 d 后，苗高基本達到8～10 cm，葉片濃綠，4～5 片真葉，根莖基部粗度達到3 mm 左右，移栽成活率達80%以上（圖1-D），這時可以移入大田進行正常的水肥管理。

3 討論與結論

前人成功建立了黃瓜（馮嘉玥 等，2008；李富童和程智慧，2020）、甜瓜（付秋實 等，2014）、南瓜（郭佳 等，2019）和絲瓜（黃麗芳 等，2019）等葫蘆科作物的離體再生體系，尤以黃瓜研究較多。影響黃瓜離體再生的因素主要包括基因型、外植體類型、激素類型和激素配比等（唐莉 等，2017）。然而目前在冬瓜中，只有趙芹等（2012）利用子葉節初步建立了冬瓜離體再生體系，不同基因型在MS+6-BA 4.0 mg·L-1+NAA 0.4 mg·L-1分化培養基上不定芽誘導率較高，最高達79.2%；但其不定芽存在不易伸長及分化畸形芽等問題，導致整體再生率較低。

本試驗在綜合分析葫蘆科不同作物再生體系的基礎上，分析了再生體系各階段不同處理對冬瓜再生效率的影響。筆者在試驗中發現冬瓜種子在消毒后催芽的過程中，因組培條件下催芽不同于大田狀態下的常規催芽處理，導致種子萌發不整齊，萌芽率不一致等現象，影響了發芽勢。通過分析2，4-D、IBA 和6-BA 不同激素處理和暗培養對不定芽誘導的影響，發現暗培養天數和2，4-D 濃度為影響誘導不定芽再生的主要因子。暗培養處理有利于黃瓜子葉節的分化再生，可能是因為暗培養條件下植物體內某些酶的合成發生了變化（王燁 等，2011；馮琴 等，2019）。在不定芽誘導初期，適宜濃度的2，4-D可以有效促進生長狀態良好的胚狀愈傷組織的形成（馮琴 等，2019）。根據正交試驗結果，誘導不定芽分化的最優配比組合為MS+2，4-D 0.1 mg·L-1+IBA 0.10 mg·L-1+6-BA 0.8 mg·L-1暗培養7 d，沒有出現在本試驗的處理中，后續將進一步開展試驗驗證。此外，本試驗還分析了不同濃度激素組合對冬瓜再生芽繼代擴繁的影響，建立了高效的無菌苗生根體系和馴化、移栽體系。

綜上，本試驗建立了完整的冬瓜子葉節再生體系：以MS 培養基為冬瓜無菌種子的萌發培養基，1/3 子葉和2 mm 下胚軸的子葉節為轉化外植體，在MS+2，4-D 0.1 mg·L-1+IBA 0.10 mg·L-1+6-BA 0.8 mg·L-1培養基中暗培養7 d 誘導再生芽，在MS+NAA 0.05 mg·L-1+6-BA 0.2 mg·L-1培養基上繼代擴繁，在生根培養基1/2MS+NAA 0.2 mg·L-1中生根后完成馴化移栽。冬瓜再生體系的建立為冬瓜遺傳轉化研究提供了技術支持，為進行基于遺傳轉化的冬瓜基因功能驗證奠定了基礎。