大白菜細菌性角斑病抗性鑒定方法的建立

任峻輝 劉 焱 吉晶晶 陳志強 張耀偉

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030）

大白菜細菌性角斑病是猝發(fā)性病害，對大白菜的產(chǎn)量及品質(zhì)影響較大。近年來該病害不僅發(fā)生得愈加頻繁而且發(fā)病地域越來越廣泛，華北、東北地區(qū)發(fā)生普遍，山東、河南、四川等地也均有發(fā)生，抗細菌性角斑病已成為大白菜育種的重要方向。抗病育種需要有抗病種質(zhì)資源，簡單有效的接種鑒定方法是鑒定資源抗病性的前提，也是抗病育種的基礎(chǔ)。大白菜細菌性角斑病發(fā)現(xiàn)近60 年，發(fā)病呈上升趨勢，但至今還未見關(guān)于大白菜抗細菌性角斑病鑒定方法的報道。細菌性角斑病的病原菌為丁香假單孢菌（Pseudomonas syringae），能侵染多種蔬菜作物（Bull et al.，2004，2015；Harighi，2007；Takikawa &Takahashi，2014；Nay et al.，2019）。生產(chǎn)中黃瓜細菌性角斑病發(fā)病相對較重，較早地建立了黃瓜細菌性角斑病的抗性鑒定方法（關(guān)鐘燕，1990；馬柏壯 等，2013）。本試驗研究了不同接種溫度、接種濕度、接種苗齡以及接種濃度對大白菜苗期細菌性角斑病發(fā)病的影響，以期建立大白菜細菌性角斑病的抗性鑒定方法，為大白菜抗細菌性角斑病種質(zhì)資源篩選以及抗病育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

大白菜細菌性角斑病病樣于2018 年8 月采自哈爾濱市向陽鄉(xiāng)東北農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗實習(xí)基地大白菜育種譜地，供試大白菜為東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院選育的自交系A(chǔ)224-1（感病）、264-1-1（感病）、203-1（耐病）及331-1（抗病）。

1.2 試驗方法

1.2.1 細菌性角斑病病原菌分離 取發(fā)病株葉片，用清水沖洗干凈，在無菌環(huán)境下切取病健交界處5 mm × 5 mm 的小塊，浸入70%乙醇中消毒3～4 s，再用無菌水反復(fù)清洗4～5 次，每次清洗3 min；然后用滅菌玻璃棒將表面消毒后的病葉組織研碎，并加入少量無菌水稀釋，用涂布棒蘸取菌液均勻涂在KB 固體培養(yǎng)基上，放入28 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)；待單菌落出現(xiàn)，挑取單菌落于KB 液體培養(yǎng)基中擴繁菌株，備用（張吉光 等，2010）。

1.2.2 病原菌分子鑒定 采用16S rDNA 通用引物1492R（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3′）/27F（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）、gyrB基因引物UP-1E（5′-TGTAAAACGACGGCCAGTGCNG GRTCYTTYTCYTGRCA-3′）/APrU（5′-CAGGAAA CAGCTATGACCAYGSNGGNGGNAARTTYRA-3′）和rpoD基因引物70R（5′-ACGACTGACCCGGT ACGCATGTAYATGMGNGARATGGGNACNGT-3′）/70F（5′-ACGACTGACCCGGTACGCATGTAYA TGMGNGARATGGGNACNGT-3′）對菌株進行PCR擴增（Yamamoto et al.，2000），擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，對單一、清晰的亮帶進行膠回收。將膠回收產(chǎn)物與Buffer 按4V∶1V混合，按上述步驟再進行凝膠電泳，回收產(chǎn)物送華大基因科技股份有限公司進行測序，測序結(jié)果與NCBI 進行比對、鑒定。

1.2.3 大白菜細菌性角斑病抗性鑒定方法 采用三因素三水平正交試驗設(shè)計，按L9（34）正交表（表1）設(shè)置9 個處理（表2），分析接種苗齡、濕度及溫度對大白菜細菌性角斑病發(fā)病的影響。以噴接無菌KB 液體培養(yǎng)基作為對照，每處理20 株，3次重復(fù)。

表1 L9（34）正交試驗因素水平表

將大白菜自交系A(chǔ)224-1 分3 期播種于7 cm ×7 cm 的營養(yǎng)缽中，每期間隔5 d；每缽播3 粒，拉十字期留1 株；置于日光溫室內(nèi)，晝/夜溫度控制在25～28 ℃/15～18 ℃，待幼苗分別長至3～4 葉期、5～6 葉期、7～8 葉期進行接種試驗。為達到最佳接種條件，接種試驗在人工氣候室中進行。病原菌菌株用KB 液體培養(yǎng)基擴繁，采用分光光度計法測定細菌懸浮液濃度并稀釋到1 × 108cfu·mL-1；采取噴接方式，每株選1 片幼葉進行接種并做好標記，每株接種量1.5～2.0 mL，接種后保濕48 h。于接種7 d 后調(diào)查發(fā)病情況。

得到最佳接種苗齡、接種濕度及接種溫度后，將供試菌株配制成3 個不同濃度菌液：1 × 108、1 × 1010、1 × 1012cfu·mL-1，分別接種于不同抗性的3 個大白菜自交系264-1-1、331-1 和203-1 上，保濕24 h。分別于接種后7、10 d 調(diào)查發(fā)病情況，從而確定最佳接種濃度。

1.2.4 病情分級與發(fā)病情況調(diào)查 采用Image J 軟件測量發(fā)病的葉片面積和病斑面積，以病斑面積與葉片面積的比率劃分病情等級：0 級，不發(fā)病；1級，病斑面積＜20%；3 級，20%≤病斑面積＜40%；5 級，40% ≤病斑面積＜60%；7 級，60%≤病斑面積＜80%；9 級，病斑面積≥80%。

群體分級標準參照“九五”國家攻關(guān)組制定的病毒病和霜霉病的群體分級標準。免疫（I）：病情指數(shù)為0；高抗（HR）：0 ＜病情指數(shù)≤11.11；抗病（R）：11.11 ＜病情指數(shù)≤33.33；耐病（T）：33.33 ＜病情指數(shù)≤55.55；感病（S）：55.55 ＜病情指數(shù)≤77.77；高感（HS）：77.77 ＜病情指數(shù)≤100.00。

1.3 數(shù)據(jù)處理

將病情指數(shù)進行平方根轉(zhuǎn)換后，采用DPS 9.50數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進行方差分析和差異多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 大白菜細菌性角斑病病原菌分離、鑒定

取田間發(fā)病株（圖1）進行病原菌分離、純化，獲得ALP-1 菌株。該菌株在KB 固體培養(yǎng)基的表面上菌落顯現(xiàn)為乳白色，扁平、近圓形或略呈不規(guī)則形；單菌落的直徑為5～7 mm，中央凸起且具同心環(huán)紋；邊緣呈透明狀。菌體短桿狀，極生鞭毛。病原菌經(jīng)16S rDNA、gyrB和rpoD基因擴增、測序，與NCBI 網(wǎng)站比對后鑒定為丁香假單孢菌Pseudomonas syringaepv.syringaevan Hall。按照柯赫氏法則，將ALP-1 菌株接種于大白菜自交系A(chǔ)224-1 上，發(fā)病癥狀與田間癥狀一致；取接種后病斑進行病原菌再分離、鑒定，鑒定病原與接種的菌株ALP-1 完全一致。確定采自哈爾濱市向陽鄉(xiāng)東北農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗實習(xí)基地的大白菜細菌性角斑病病原菌為丁香假單孢菌丁香致病型（Pseudomonas syringaepv.syringaevan Hall）。

2.2 接種苗齡、濕度及溫度對大白菜細菌性角斑病發(fā)病的影響

2.2.1 不同處理的發(fā)病情況 從表2 可以看出，大白菜細菌性角斑病發(fā)病率和病情指數(shù)最高的均是處理3，處理2 次之。參照“九五”國家攻關(guān)組制定的大白菜病毒病和霜霉病的群體分級標準和其他病害抗性鑒定等級劃分標準（馬燕勤 等，2018；孫葉爍 等，2019），處理2 的病情指數(shù)為30.06，屬于抗病等級。而2018 年自交系A(chǔ)224-1 田間發(fā)病重于其他育種材料，同時7～8 葉期大白菜接種3 d后開始發(fā)病，明顯早于3～4 葉期和5～6 葉期。綜合各方面因素考慮，處理3（苗齡7～8 葉期、接種溫度25～30 ℃、接種濕度90%～100%）為大白菜細菌性角斑病發(fā)病的最佳條件組合。

表2 試驗設(shè)計及極差分析結(jié)果

2.2.2 病情指數(shù)極差分析 為了分析接種苗齡、接種溫度、接種濕度對大白菜細菌性角斑病發(fā)病的影響程度，對這3 個因素進行極差分析。由表2 可以看出，接種溫度的極差最大，其次為接種濕度，接種苗齡的極差最小。表明苗期抗性鑒定受接種溫度的影響最大，接種濕度影響次之，接種苗齡對其影響最小，且最佳優(yōu)化條件為A3B3C3。

2.2.3 病情指數(shù)方差分析 進一步的方差分析結(jié)果表明（表3），C 因素和B 因素的F值均大于F0.01=6.23，說明這兩個因素各水平間差異達極顯著水平，二者對細菌性角斑病發(fā)病的影響均較大；A 因素F值小于F0.05=3.93，不同苗齡間差異不顯著。方差分析結(jié)果與極差分析的結(jié)果基本保持一致。

表3 大白菜細菌性角斑病病情指數(shù)方差分析結(jié)果

2.3 不同接種濃度對大白菜細菌性角斑病發(fā)病的影響

確定大白菜細菌性角斑病發(fā)病的最優(yōu)條件組合后，選取田間有抗感差異的3 個大白菜自交系264-1-1、203-1、331-1 進行最佳接種濃度篩選。從表4 可以看出，當菌液濃度達到1 × 1010cfu ·mL-1時，接種10 d 后3 個自交系的病情指數(shù)分別為33.21、40.27、57.95，分別表現(xiàn)為抗病、耐病、感病；1 × 108cfu·mL-1和1 × 1012cfu·mL-1濃度菌液接種10 d 以及3 個濃度菌液接種7 d，3 個自交系之間抗感差異區(qū)分度欠佳。所以最佳接種濃度為1 × 1010cfu·mL-1，應(yīng)在接種后10 d 進行調(diào)查。

表4 不同接種濃度對大白菜細菌性角斑病發(fā)病的影響

3 結(jié)論與討論

大白菜細菌性角斑病的最適發(fā)病溫度為25～28 ℃（張淑霞 等，2006），本試驗設(shè)計了3 個接種溫度：15～20 ℃、20～25 ℃和25～30 ℃，為了更接近于自然環(huán)境將晝夜溫差設(shè)置為5 ℃。試驗結(jié)果表明溫度因素對細菌性角斑病發(fā)病影響較大，15～20 ℃不利于發(fā)病，25～30 ℃發(fā)病較重，說明高溫有利于細菌性角斑病發(fā)病。本試驗接種后發(fā)現(xiàn)濕度越大發(fā)病越明顯，在接種濕度為90%～100%的條件下最易發(fā)病，這一結(jié)論與張淑霞等（2006）陰雨天易發(fā)病且病菌會借風(fēng)雨和灌溉水等方式進行傳播的研究結(jié)果相符。本試驗確定適宜的接種溫度為25～30 ℃、接種濕度為90%～100%，符合細菌性角斑病田間發(fā)病規(guī)律和發(fā)病基本條件，筆者多年田間觀察發(fā)現(xiàn)大白菜細菌性角斑病多在8 月上中旬、大雨過后空氣潮濕的時候大面積發(fā)生，而且發(fā)病程度更為嚴重。

目前，關(guān)于大白菜細菌性角斑病接種的最適苗齡未見報道。據(jù)田間發(fā)病調(diào)查統(tǒng)計結(jié)果，大白菜進入蓮座期且遇陰雨天氣時易發(fā)病，而且多在大白菜外葉發(fā)生，嚴重時病斑會相互連片。本試驗結(jié)果表明，接種苗齡對發(fā)病的影響與接種溫度和接種濕度相比屬于次要因素，但是不同接種苗齡仍然對大白菜細菌性角斑病發(fā)病產(chǎn)生影響，7～8 葉期接種更容易發(fā)病。說明大白菜細菌性角斑病在大苗齡植株上更易發(fā)病，這也與田間觀察結(jié)果相符。

盡管到目前為止，還未見大白菜細菌性角斑病抗性鑒定方法方面的報道，但是接種濃度對蔬菜作物抗病性鑒定結(jié)果的影響應(yīng)該是很大的，濃度過低植株不易發(fā)病，而濃度過高會導(dǎo)致耐病品種和抗病品種發(fā)病程度偏重，不易于區(qū)分不同品種間的抗性差異。本試驗結(jié)果表明，接種濃度對大白菜細菌性角斑病發(fā)病的影響較大，菌液濃度為1 × 1010cfu ·mL-1時，接種10 d 后可以區(qū)分不同品種間的抗、感病差異，因此確定該濃度為大白菜苗期活體接種的最佳濃度。

本試驗僅是對大白菜細菌性角斑病抗性鑒定方法的初次探討，希望能對我國大白菜抗細菌性角斑病育種提供借鑒。