兩種可吸收生物膜聯(lián)合去蛋白牛骨基質(zhì)植入犬拔牙窩成骨的影像學(xué)評價

王思雯，尤鵬越，劉玉華，王新知，唐 琳，王 梅

(北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院·口腔醫(yī)院，修復(fù)科 國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 口腔數(shù)字化醫(yī)療技術(shù)和材料國家工程實(shí)驗(yàn)室 口腔數(shù)字醫(yī)學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081)

近年來，種植修復(fù)技術(shù)作為修復(fù)牙齒缺失的方法已得到越來越廣泛的臨床應(yīng)用，然而種植體植入位點(diǎn)的骨量不足及骨質(zhì)不佳極大影響了種植體植入的成功率以及長期存活率[1-2]。以往研究表明，在拔牙后的3年內(nèi)，自然愈合的拔牙窩牙槽骨吸收量可達(dá)40%～60%[3]。在拔牙窩內(nèi)的血凝塊形成后，上皮和結(jié)締組織會優(yōu)先長入拔牙窩內(nèi)，從而對骨組織的形成產(chǎn)生競爭性抑制[4]。引導(dǎo)性骨再生技術(shù)(guided bone regeneration, GBR)通過在骨缺損上覆蓋屏障膜，阻止缺損周圍的成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞快速長入，既保護(hù)了血凝塊，也為成骨細(xì)胞的遷移、增殖和分化提供一個穩(wěn)定的環(huán)境，對促進(jìn)骨缺損區(qū)域新骨形成有重要作用[5]。有研究表明，在拔牙同期采用屏障膜和/或骨移植材料的GBR技術(shù)能夠減少牙槽骨的吸收，從而實(shí)現(xiàn)硬組織的保存，減少后續(xù)種植手術(shù)的風(fēng)險[6]。

目前，臨床上在拔牙后GBR技術(shù)中應(yīng)用最為廣泛的屏障膜是豬膠原來源可吸收生物膜Bio-Gide?(簡稱Bio-Gide膜)，已有大量實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)了其應(yīng)用效果[7-8]。研究者們?nèi)灾铝τ陂_發(fā)降解時間更長、機(jī)械性能更強(qiáng)的可吸收生物膜，以保證膜材料在具有良好的生物相容性的情況下，能夠進(jìn)一步穩(wěn)定成骨空間，達(dá)到更佳的骨修復(fù)效果。

豬小腸黏膜下層(small intestinal submucosa, SIS)是一種細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)材料，具有天然的三維支架結(jié)構(gòu)，并且含有糖蛋白、糖胺聚糖和各種生長因子，對促進(jìn)骨再生有積極的效果。目前已有小型動物實(shí)驗(yàn)證明，應(yīng)用SIS膜修復(fù)骨缺損達(dá)到的骨再生程度與Bio-Gide膜類似[9]，且SIS膜比Bio-Gide膜具有更長的降解周期和更優(yōu)的機(jī)械性能[10]，有望達(dá)到更佳的引導(dǎo)性骨再生效果。

本研究將復(fù)層豬小腸黏膜下層膜(multilamina-ted SIS, 簡稱mSIS膜)和Bio-Gide膜聯(lián)合去蛋白牛骨基質(zhì)應(yīng)用于犬拔牙窩模型，并采用微計(jì)算機(jī)體層掃描(micro-computed tomograph, Micro-CT)方法評價拔牙窩內(nèi)骨再生的效果。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料和試劑主要有：復(fù)層豬小腸黏膜下層(北京大清生物技術(shù)股份有限公司，中國)、Bio-Gide?可吸收生物膜(Geistlich公司，瑞士)、Bio-Gide?去蛋白牛骨基質(zhì)骨替代材料(0.25～1.00 mm顆粒，Geistlich公司，瑞士)、戊巴比妥鈉(Sigma公司，美國)、青霉素鈉(80萬單位，華北制藥股份有限公司，中國)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物及倫理

3只比格犬，年齡18～24個月，體質(zhì)量12.1～14.5 kg，檢疫合格，于軍事科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心動物房飼養(yǎng)。所有犬在實(shí)驗(yàn)全程進(jìn)食軟食，自由飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)至少1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號：LA2018293)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

3只實(shí)驗(yàn)用犬隨機(jī)編號為1～3號，選擇雙側(cè)上下頜前磨牙區(qū)域?yàn)樾g(shù)區(qū)，其中一側(cè)上下頜在距離動物處死前12周進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，另一側(cè)在動物處死前4周進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。拔除每只動物上頜第二和第三前磨牙，以及下頜第二至第四前磨牙的遠(yuǎn)中部分，得到前磨牙遠(yuǎn)中拔牙窩。在每一側(cè)的5個拔牙窩中隨機(jī)選取3個拔牙窩用于本實(shí)驗(yàn)，4周、12周時各有9個拔牙窩，平均隨機(jī)分為以下3組，每組3個重復(fù)拔牙窩：(1)mSIS組，拔牙窩內(nèi)植入Bio-Oss骨粉并覆蓋mSIS膜；(2)BG組，拔牙窩內(nèi)植入Bio-Oss骨粉并覆蓋Bio-Gide膜；(3)空白對照組，拔牙窩自然愈合。各組拔牙窩處理方法見圖1。

A, mSIS group, sockets filled with Bio-Oss and covered by mSIS; B, BG group, sockets filled with Bio-Oss and covered by Bio-Gide; C, blank control group, no treatment. mSIS, multilaminated small intestinal submucosa membrane.圖1 各組拔牙窩的處理方法Figure 1 Schematic representation of the treatment of all groups

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

按1 mL/kg的劑量靜脈注射3%(體積分?jǐn)?shù))戊巴比妥鈉對實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行全身麻醉，至動物角膜反射消失。手術(shù)步驟如圖2所示，采用2%(體積分?jǐn)?shù))碘伏消毒口周，暴露動物一側(cè)上下頜前磨牙區(qū)(圖2A)，采用0.12%(體積分?jǐn)?shù))氯己定溶液消毒口內(nèi)。使用牙齦分離器對前磨牙頰舌側(cè)牙齦分齦，翻開牙齒頰舌側(cè)黏膜全厚瓣達(dá)膜齦聯(lián)合處。在大量冷卻生理鹽水的沖洗下，使用渦輪機(jī)將前磨牙沿頰舌向半切達(dá)根分歧處(圖2B)。對前磨牙近中根進(jìn)行根管治療和樹脂充填，并拔除遠(yuǎn)中根(圖2C)。取mSIS膜和Bio-Gide膜修剪其長寬至適合拔牙窩大小，將膜的一端伸入拔牙窩舌側(cè)骨板和牙齦之間，將已在無菌生理鹽水中浸潤5 min的Bio-Oss骨粉植入并填滿整個拔牙窩(圖2D)，再將膜的另一端伸入拔牙窩的頰側(cè)骨板與牙齦之間至覆蓋整個拔牙窩(圖2E)。無張力復(fù)位齦瓣，使用5-0可吸收線間斷縫合傷口(圖2F)。在該側(cè)實(shí)驗(yàn)完成后(12周組)，于8周后對同一只動物的另一側(cè)上下頜進(jìn)行實(shí)驗(yàn)(4周組)，操作步驟同上。

A, preoperative photograph; B, teeth were hemisected; C, distal roots were extracted; D, the sockets were filled with Bio-Oss; E, the sockets were covered by membranes; F, primary closure of the sites.圖2 手術(shù)步驟Figure 2 Clinical view of the surgical procedures

術(shù)后連續(xù)3天給予實(shí)驗(yàn)動物肌肉注射80萬單位青霉素鈉，予0.12%氯己定溶液口腔沖洗(每周2次)。術(shù)后密切觀察實(shí)驗(yàn)動物狀態(tài)及飲食情況，并檢查術(shù)區(qū)傷口愈合情況，之后每周定期對動物進(jìn)行全身狀態(tài)觀察以及術(shù)區(qū)檢查。

1.5 標(biāo)本獲取

于每只實(shí)驗(yàn)動物最后一次手術(shù)4周后采用3%戊巴比妥鈉靜脈注射再次麻醉動物，并行空氣栓塞法處死。截取上頜第二和第三前磨牙區(qū)域，以及下頜第二至第四前磨牙區(qū)頜骨組織獲取標(biāo)本，10%(體積分?jǐn)?shù))中性甲醛緩沖溶液固定。

1.6 Micro-CT檢測

于北京大學(xué)口腔醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室對所有標(biāo)本進(jìn)行Micro-CT掃描，檢查系統(tǒng)為SIEMENS INVEON。掃描條件為：電壓80 kV，電流500 μA，曝光時間1 000 ms，有效體素 13.18 μm，將標(biāo)本旋轉(zhuǎn)360°進(jìn)行掃描。

使用軟件Inveon Research Workplace 4.2對得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，在General Analysis中圈選牙槽窩區(qū)域。通過調(diào)整新生骨灰度值范圍使其覆蓋新生骨區(qū)域，并計(jì)算整個牙槽窩內(nèi)的新生骨容積比例(bone volume fraction, BV/TV)和新生骨密度(bone mineral density, BMD)。然后以牙槽窩近遠(yuǎn)中牙槽嵴頂部連線為牙槽窩冠方邊緣，以牙槽窩根尖為根方邊緣，將牙槽窩劃分為冠1/3、中1/3和根1/3三個部分，分別計(jì)算各區(qū)域的新生骨容積比例(BV/TV-1、BV/TV-2、BV/TV-3)。通過骨形態(tài)學(xué)分析，計(jì)算得到牙槽窩內(nèi)新生骨的骨小梁數(shù)量(trabecular number, Tb.N)、骨小梁分離度(trabecular spacing, Tb.Sp)以及骨小梁厚度(trabecular thickness, Tb.Th)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用ANOVA單因素方差分析對實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)以每組的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用IBM SPSS 22.0(SPSS Inc，Chicago IL，USA)軟件，檢驗(yàn)數(shù)據(jù)復(fù)合正態(tài)性和方差齊性后，行ANOVA單因素方差分析，組間比較采用Post Hoc的LSD分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

手術(shù)后1周內(nèi)對動物進(jìn)行全身情況以及術(shù)區(qū)情況檢查，所有動物精神狀態(tài)良好，活動自如，飲食正常，術(shù)區(qū)傷口正常愈合，未出現(xiàn)傷口裂開和感染。

2.1 Micro-CT圖像觀察

選取Micro-CT圖像中各實(shí)驗(yàn)組拔牙窩的冠狀面、矢狀面圖以及水平面截圖進(jìn)行觀察(圖3、4)。

mSIS, multilaminated small intestinal submucosa membrane; BG, Bio-Gide; Micro-CT, micro-computed tomography.圖3 術(shù)后4周牙槽窩新生骨Micro-CT圖像(黃色箭頭示新生骨，綠色箭頭示骨移植材料)Figure 3 Micro-CT images at 4 weeks of healing showing new bone (yellow arrows) and bone substitute materials (green arrows)

Abbreviations as in Figure 3.圖4 術(shù)后12周牙槽窩新生骨Micro-CT圖像(黃色箭頭示新生骨，綠色箭頭示骨移植材料)Figure 4 Micro-CT images at 12 weeks of healing showing new bone (yellow arrows) and bone substitute materials (green arrows)

術(shù)后4周時，空白對照組拔牙窩內(nèi)可見由四周骨壁向拔牙窩中心生長的新生骨組織，骨小梁結(jié)構(gòu)清晰，中心區(qū)域?yàn)榇竺娣e低密度影像，拔牙窩中央及齦方空虛，缺少新骨充填。mSIS組及BG組在牙槽窩內(nèi)可見高密度影像的骨移植材料，顆粒狀不規(guī)則形態(tài)的骨粉顆粒填充滿整個牙槽窩，新生骨組織不僅見于牙槽窩四壁，還圍繞骨粉顆粒大量存在，密度低于骨粉，與四周骨壁有明顯的界限。除了骨粉及新骨，牙槽窩內(nèi)仍可見小面積的低密度骨髓腔存在。

術(shù)后12周時，空白對照組拔牙窩中央仍有大面積空虛區(qū)域，四周的新生骨組織與骨壁邊界不清，可見少量骨小梁。mSIS和BG組拔牙窩內(nèi)的新生骨組織密度較術(shù)后4周時有明顯增加，與四周骨壁已無明顯界限，大量的新生骨組織包繞骨粉并充滿整個拔牙窩。

2.2 Micro-CT定量分析

計(jì)算各組在各時間點(diǎn)牙槽窩內(nèi)新生骨的BV/TV，結(jié)果見表1～2。mSIS組和BG組在術(shù)后4周和12周整個牙槽窩內(nèi)的BV/TV均顯著高于對照組(P<0.05)，而mSIS組略好于BG組，但兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

mSIS組和BG組在各時間點(diǎn)的冠1/3、中1/3和根1/3的新生骨容積比例(BV/TV-1、BV/TV-2、BV/TV-3)均顯著高于空白對照組(P<0.05)，mSIS組和BG組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 術(shù)后4周及12周各組牙槽窩內(nèi)新生骨容積比例Table 1 New bone fraction of all groups at

術(shù)后4周時，mSIS組和BG組的BV/TV-1顯著高于BV/TV-2和BV/TV-3(P<0.05)，空白對照組牙槽窩各區(qū)域間BV/TV的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。術(shù)后12周時，各組的BV/TV-1均高于BV/TV-2和BV/TV-3，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 術(shù)后4周及12周各組牙槽窩內(nèi)分區(qū)域的新生骨容積比例Table 2 New bone fraction of all groups in coronal, middle and apical third of the socket at 4 and 12 weeks (%,

各組在各時間點(diǎn)牙槽窩內(nèi)新生骨密度的結(jié)果如表3所示。術(shù)后4周，mSIS組、BG組和對照組的新生骨密度值接近，各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。術(shù)后12周，mSIS組和BG組的新生骨密度值顯著高于對照組(P<0.05)，mSIS組略高于BG組，但兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 術(shù)后4周、12周各組牙槽窩內(nèi)新生骨密度Table 3 Bone mineral density of all groups at

對各組Micro-CT數(shù)據(jù)進(jìn)行骨形態(tài)學(xué)分析，術(shù)后4周及12周的Tb.N、Tb.Sp和Tb.Th如表4所示。mSIS組和BG組在術(shù)后4周和12周時的Tb.N顯著高于對照組(P<0.001)，mSIS組略好于BG組，但兩組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。mSIS組和BG組術(shù)后4周和12周的Tb.Sp值顯著低于對照組(P<0.05)，mSIS組與BG組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。術(shù)后4周和12周各實(shí)驗(yàn)組之間Tb.Th的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表4 術(shù)后4周及12周各組牙槽窩內(nèi)骨形態(tài)學(xué)分析Table 4 Bone morphometric analysis of all groups at

3 討論

臨床上，維持牙齒拔除后牙槽骨充足的骨量與骨質(zhì)是種植修復(fù)技術(shù)成功的關(guān)鍵之一。犬在骨組織成分和骨質(zhì)結(jié)構(gòu)上與人體具有一定的相似性[11]，其上下頜骨結(jié)構(gòu)也較接近人體的解剖構(gòu)造。相較于小型實(shí)驗(yàn)動物，犬的上下頜骨能夠更好地建立模擬人體的拔牙窩模型。由于犬上下頜前磨牙區(qū)域牙齒數(shù)量較多且牙齒大小相差較小，是制造拔牙窩常選擇的實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)。研究者們?yōu)榱四M臨床上單顆牙齒缺失時的情形，選擇拔除前磨牙的遠(yuǎn)中根并保留近中根，建立間隔拔牙窩模型[12-13]。本實(shí)驗(yàn)參考既往研究，將前磨牙分根后的遠(yuǎn)中部分拔除，對于出現(xiàn)牙髓暴露的近中部分，采取了根管治療的處理方法，消除了可能的牙髓炎癥對遠(yuǎn)中拔牙窩實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)的影響。

維持拔牙窩內(nèi)穩(wěn)定的成骨空間對新骨再生非常重要。在引導(dǎo)性骨再生技術(shù)中，屏障膜不僅需要阻止骨缺損周圍纖維結(jié)締組織的快速長入，還要承受覆蓋在缺損上方軟組織的壓力，防止成骨空間的塌陷。本研究采用的mSIS膜由8層單層的SIS膜復(fù)合而成，彌補(bǔ)了單層SIS膜機(jī)械性能較差且易塌陷的問題[9]。將mSIS膜或Bio-Gide膜覆蓋于植入Bio-Oss骨粉的拔牙窩上，可觀察到骨粉顆粒穩(wěn)定存在于拔牙窩內(nèi)，在愈合過程中，拔牙窩的冠方表面略有凸起，而自然愈合的空白對照組牙槽窩表面呈凹陷狀。Bio-Gide膜聯(lián)合Bio-Oss骨粉顆粒是一種較經(jīng)典的修復(fù)骨缺損的方法，已在臨床上得到了廣泛的應(yīng)用[14-15]。本研究中，BG組4周和12周的BV/TV值分別為40.34%和53.09%，與Kim等[8]和Wang等[16]的研究結(jié)果接近。mSIS組在術(shù)后4周和12周的BV/TV值分別為41.10%和58.04%，該數(shù)值顯著高于空白對照組，與BG組的數(shù)值無明顯差異。Turri等[17]的研究發(fā)現(xiàn)，使用SIS膜修復(fù)的骨缺損其新生骨比例高于自然愈合組，且高出的部分主要集中在靠近膜的缺損頂部，本研究也觀察到了相似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，術(shù)后4周mSIS組和BG組的牙槽窩冠1/3區(qū)域的新生骨百分比顯著高于其余兩個區(qū)域。屏障膜的覆蓋使缺損區(qū)域中靠近膜的部分在愈合早期即出現(xiàn)新生骨組織，使缺損頂部由屏障膜支撐變?yōu)樾律呛推琳夏す餐危欣诤罄m(xù)成骨空間的穩(wěn)定。新生骨BMD代表新生骨組織的礦化程度，術(shù)后4周時各實(shí)驗(yàn)組之間的結(jié)果無顯著差異，術(shù)后12周時mSIS組和BG組數(shù)值已顯著高于空白對照組，也表明更好的成骨環(huán)境對新生骨組織的礦化有積極的作用。

Micro-CT骨形態(tài)學(xué)分析中的骨小梁數(shù)量、骨小梁分離度以及骨小梁厚度，是代表新生骨小梁微觀結(jié)構(gòu)的重要指標(biāo)[18]。Tb.N和Tb.Th的數(shù)值越高，代表新生骨小梁越成熟；Tb.Sp的數(shù)值越低，表明骨小梁之間的間距越小，代表骨小梁排列的越緊密。良好的骨小梁形態(tài)排列及結(jié)構(gòu)對于骨組織愈合的穩(wěn)定性以及骨的質(zhì)量有著重要意義[18]。本研究中術(shù)后4周、12周各實(shí)驗(yàn)組的Tb.Th值接近，但mSIS組和BG組的Tb.N值均顯著高于空白對照組，表明在形成的新生骨小梁厚度接近的情況下，覆蓋mSIS或Bio-Gide膜的牙槽窩內(nèi)新生骨小梁數(shù)量更多，這與Kim等[8]、Leventis等[19]、Sun等[20]的研究結(jié)果一致，也印證了mSIS組和BG組的BV/TV更高的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。術(shù)后4周及12周mSIS組和BG組的Tb.Sp值均遠(yuǎn)低于對照組，這與Wu等[9]的研究結(jié)果一致，可能代表經(jīng)過mSIS膜和Bio-Gide膜覆蓋處理的拔牙窩骨再生后的新骨骨質(zhì)更佳。Omar等[21]發(fā)現(xiàn)，屏障膜在引導(dǎo)性骨再生技術(shù)中不只承擔(dān)被動屏障的角色，還能在骨再生的過程中起到生物活性屏障的作用。Turri等[17]的研究發(fā)現(xiàn)，覆蓋于缺損上的SIS膜能夠吸引不同表型的細(xì)胞，并促進(jìn)細(xì)胞順序表達(dá)和分泌與骨再生和重塑相關(guān)的因子和信號，在新骨形成和骨成熟的過程中起重要作用，這可能與覆蓋mSIS膜的實(shí)驗(yàn)組牙槽窩內(nèi)新生骨骨質(zhì)更佳相關(guān)。

綜上所述，mSIS膜作為屏障膜能夠促進(jìn)犬新鮮拔牙窩內(nèi)的新骨形成，在新生骨組織的骨量與骨質(zhì)上，mSIS膜與Bio-Gide膜的應(yīng)用效果類似，是一種具有臨床應(yīng)用前景的屏障膜材料。