延時加硫對水稻吸收硒鎘以及生理生化指標的影響

新疆環境保護科學研究院 新疆 烏魯木齊 830011

Cd是對植物危害較大的重金屬元素之一，有關植物受Cd毒害及植物體內緩解Cd毒害的機制已有大量報道[1]。S和Se均為植物體內的必須元素，且對Cd毒性具有一定的抑制作用[2-6]。同時S和Se屬于同一元素周期位的化學元素，化學性質相似，在吸收、轉運和進入生物大分子中的途徑有相同之處，植物中Se和S相互作用表現在植物對Se的吸收、同化及植物的生長發育等各方面。高等植物同化Se6+的途徑與同化的途徑基本相同。

水稻作為亞洲使用最多的糧食作物，其體內重金屬含量以及會對人類造成的損害多見報道。金屬硫蛋白[7](metallothionein，簡稱MT)為一類廣泛地存在于生物界的低分子量、富含半胱氨酸的金屬結合蛋白，尤其對Cd，Zn，Cu，Au，Ag等有較強的親和力。有很多實驗證明MT在提高植物重金屬抗性、解除對Cu，Zn，Pb，Ag，Hg，Cd等重金屬毒性方面具有重要作用，多數MT在C端和N端有兩個富含Cys的結構域，其中的巰基既可以與重金屬螯合形成無毒或低毒的絡合物[8]。

因此本文主要研究在不同S濃度下硒鎘協同作用對水稻生長特性的影響。設計實驗在無添加S條件以及10d后添加S兩種條件下，硒鎘的交互作用對水稻幼苗的影響，以闡明植物體內S對Se與Cd交互作用的影響及初步機理。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 供試植物：淮稻6號，由江蘇農科院提供。植物培養液為霍格蘭溶液。

取籽粒飽滿、均勻的水稻種子，用1.2%NaClO溶液消毒20min，均勻擺在墊有濾紙的培養皿中，加入適量去離子水，放入人工氣候箱中避光發芽5天。選取發芽情況較好，平均長度在5cm左右的水稻芽于三角燒瓶，每個三角燒瓶中放同等根數，加入適量營養液，在人工氣候箱中繼續培養5d，過程中補充消耗的營養液。人工氣候培養箱條件：光照16h，溫度28℃，濕度：75。暗室8h，溫度20℃，濕度70%。

試驗濃度的設定：處理中，配制Se濃度為0，5mg·L-1，Cd濃度為1，10mg·L-1溶液，添加S(以MgSO4形式)分別為0，48mg·L-1。霍格蘭溶液培養為對照，每組處理均設3個重復。

采樣時間：曝毒溶液培養10天后，部分處理加入48mg·L-1S，另一部分無添加S，分別在0，5，10，15，20d取樣測定，每組處理均設3個重復。

1.2 試驗方法

1.2.1 水稻幼苗生物量的測定 取樣后，將根部與莖葉分離，在100℃烘箱中烘干，用電子天平稱量干重，記下數據，并計算出每組處理的平均干重。

1.2.2 水稻幼苗葉綠素含量的測定 稱取0.1g的葉片，置于10ml比色管中，加入10m L丙酮和無水乙醇等量混合成的提取液，加塞置于4℃冰箱中下進行浸提24h后，用分光光度計測定在663nm和645nm處的吸光度，記下數據并計算。

1.2.3 水稻幼苗Cd含量的測定 將樣品的地下部分(根)和地上部分(莖葉)分開，各自保存后烘干，稱重。分別測定地上部分和地下部分的Cd含量。稱取烘干磨碎后的樣品0.01g～0.08g置于消化罐內，加入4mL硝酸和2mL雙氧水，靜置5min，加蓋后消化13min。將消化液置于錐形瓶中趕酸，冷卻后轉移至10ml容量瓶中，加入1%HNO3定容，靜置30min同時做空白試驗。微波消解后用原子吸收光譜法測出地上部分和地下部分的Cd含量。

1.2.4 水稻幼苗金屬硫蛋白(MT)含量的測定 金屬硫蛋白(MT)含量的測定：將曝毒后的水稻從燒杯中取出，用電子天平稱取水稻幼苗鮮樣組織lg，并置于研缽中，加入0.01mol/L，p H8.6的Tris-HCI緩沖液10m L，研磨后于4℃冰箱過夜抽提。抽提液于4℃，1×104r/min離心30min，收集上清。上清于100℃水浴加熱2-3min，再于4℃下，1×104r/min離心20min。收集上清，加入3倍體積-20℃預冷的無水乙醇，-20℃過夜沉淀后，4℃下，1.2×104r/min離心20min。取沉淀加入0.01mol/LTris-HCl緩沖液5mL，溶解數小時后，在4℃下1.5×104r/min離心20min，收集上清即為MT提取液。取提取液1m L用Ag飽和法測定MT含量[9]。

2 結果與分析

2.1 對水稻生物量的影響

由圖1a可知，在無S，無Se條件下低濃度Cd對水稻幼苗根干重的抑制比高濃度Cd小。在無Se條件下，無論是低濃度Cd還是高濃度Cd，在第10 d加入S之后，水稻幼苗根干重明顯高于無添加S組，且由圖可知，Cd為10 mg/L時，添加S之后，水稻幼苗根干重的數值高于Cd為1mg/L，未添加S時的根干重。且當Cd濃度為1mg/L，添加S之后，在第20d時，水稻幼苗根干重數值高于對照組。由此證明，S的添加對Cd的毒性起到了一定的緩解作用。

圖1 水稻幼苗根干重隨時間的變化(a：無Se；b：Se=5mg/L)

見圖1b，水稻幼苗添加Se之后，在無添加S情況下，Se與低濃度Cd產生一定拮抗作用，與高濃度Cd產生一定的協同作用。在添加S情況下，當Cd濃度為10mg/L時，第20d水稻幼苗根干重數值較其它有Cd脅迫條件下的數值高，說明雖然Se與高濃度Cd具有一定協同作用，但S的添加顯著抑制了二者協同時對水稻的毒害，證明S對兩種元素協同作用的抑制較為顯著。推測有可能是因為，S的添加分別抑制了水稻對Se、Cd的吸收，從而達到抑制作用。

見圖2a，無添加Se時，水稻幼苗莖干重的變化趨勢與根干重變化趨勢較類似，但由于莖干重數值與對照組相比，差別并不顯著所以推測，Cd對根部的毒性大于Cd對莖部的毒性，主要是因為水稻由根部吸收Cd，而向莖部轉移量較少，因此Cd對水稻幼苗莖的毒性低于對根的毒性。

圖2 水稻幼苗莖干重隨時間的變化(a：無Se；b：Se=5mg/L)

見圖2b，在添加Se條件下，Cd為10mg/L，添加S之后，第15d，水稻幼苗莖干重數值高于對照組，因此在一定意義上反映出，S的存在抑制了Se、Cd協同作用對水稻的毒害，甚至S的添加使得水稻長勢良好。

見圖3，4水稻幼苗根、莖長度的變化趨勢與水稻幼苗根、莖干重變化趨勢大體相同，在此不再贅述。

圖3 水稻幼苗根長隨時間的變化(硒為5mg/L)

圖4 水稻稻幼苗莖長隨時間的變化(硒為5mg/L)

由以上4張圖可以看出，水稻幼苗根生物量隨時間而增大。高濃度Cd較低濃度Cd對水稻的毒害更加明顯。

此外，可以看出在低濃度Cd條件下，加Se組水稻幼苗長勢比較良好，高濃度Cd條件下，為現明顯區別。故推測，Se在低濃度Cd下，與其產生拮抗，抑制了Cd對水稻的毒害。而在高濃度Cd下，與其產生一定的協同作用，故并未顯著減小其對水稻幼苗的毒性。

第10d加入S，水稻幼苗的生長趨勢隨時間逐漸變好，無添加S組，水稻幼

苗根莖生物量也有增加，但增長趨勢較添加S組，漲幅不明顯。

2.2 對水稻葉綠素含量的影響

見圖5對比高濃度，在低濃度鎘情況下，低濃度鎘對水稻幼苗葉綠素的抑制相對高濃度不明顯。對比同濃度鎘，在第十天加入S之后，水稻幼苗葉綠素含量高于未加S組。

圖5 水稻幼苗葉綠素含量隨時間的變化(b：Se為5mg/L)

2.3 對水稻體內鎘含量的影響

由圖6可以看出，無添加S情況下，水稻對Cd的吸收速率相對較快，在第10d加入S之后，雖然Cd仍在水稻體內累積，但相對于未加入S組，Cd的累積速率明顯受到抑制，說明S的添加抑制的水稻對Cd的吸收，從而達到緩解Cd毒害的作用。

圖6 水稻幼苗Cd含量隨時間的變化(a：根部，Se為5mg/L；b：莖部，Se為5 mg/L)

此外，可以看出，水稻幼苗莖和根部鎘累積隨時間均在增加，并且Cd在根部的累積量以及累積速率均高于莖部，高濃度鎘在水稻體內的含量明顯高于低濃度鎘在水稻體內的累積。對比10d加入S和無添加S組，可以看出在加入S后，水稻體內對Cd的吸收速率降低，且累積量也有所下降。證明S的添加減緩了水稻吸收Cd的速率。

對比圖7可以看出，高濃度Cd對金屬硫蛋白的誘導量高于低濃度Cd，并且對照組的金屬硫蛋白隨時間并未發生顯著變化，由此推斷只有在Cd存在時，金屬硫蛋白才可能被誘導。

添加S組水稻體內合成的金屬硫蛋白含量高于無S添加組，證明S的存在為水稻體內合成金屬硫蛋白提供了原料。此外，由于在無S情況下，MT也能夠被誘導產生，因此推測，Se的存在在一定程度上也能夠替代S產生MT。其可能的主要機制為，Se的存在誘導產生金屬硫蛋白，Se成為MT中心，即Se代金屬硫蛋白。

3 結論

相較于低濃度Cd，高濃度Cd對水稻的毒害更加明顯，且高濃度Cd誘導產生更多的MT；相較于無Se組，添加Se，與低濃度Cd產生拮抗效應，抑制Cd的毒害，與高濃度Cd產生協同作用，相互促進水稻對二者的吸收，從而說明加硒未能抑制高濃度Cd的毒性；

第10d加入S，與無添加S組相比，對水稻的各項生理生化指標均有明顯的促進作用，且MT的含量也明顯增多。S的加入明顯抑制了水稻幼苗對Se、Cd的吸收，降低了Se與Cd在水稻幼苗體內的累積。MT在無S情況下也可產生，且添加Se組MT含量高于未添加Se組，推測水稻體內原始存在的S先被消耗合成MT，接著Se的供給在一定程度上代替S合成MT。