針刺結合中藥對卒中相關性肺炎大鼠干預效應的實驗研究

王 穎，許 麗，吳海洋，李良勇

(1.安徽中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院 腦病科，安徽 合肥 230000；2.安徽中醫(yī)藥大學，安徽 合肥 230000；3.安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院 腦病科，安徽 合肥 230000)

隨著社會的發(fā)展及人口老齡化，腦卒中作為一種常見的腦血管疾病，其發(fā)生率、致殘率及病死率正逐年升高。據世界衛(wèi)生組織報告顯示，腦卒中是在世界范圍內的第3位死亡原因，僅次于冠心病和癌癥，在我國目前是致殘率第一、致死率第二的高發(fā)疾病，嚴重影響患者的身心健康[1]。研究表明[2]，在腦卒中眾多的并發(fā)癥中，卒中相關性肺炎為最常見的并發(fā)癥之一，也是導致卒中患者死亡的主要原因，其占7%～22%[3]。卒中相關性肺炎(stroke-associated pneumonia，SAP)的概念由Hilker[4]在2003年首次提出。目前關于SAP的發(fā)生機制尚不明確，其發(fā)病可能與卒中后免疫抑制狀態(tài)、細菌種植、吞咽功能障礙等因素密切相關[5]。且SAP相關的危險因素有高齡、吞咽困難、神經功能缺損及合并的一些慢性疾病，如慢阻肺、糖尿病等，這些危險因素都會引起SAP的發(fā)生和加劇病情的發(fā)展。目前關于SAP的西醫(yī)治療主要以使用抗生素為主，但長期使用容易引起耐藥菌的產生、機體菌群失調等不良后果。因此，如何發(fā)揮中醫(yī)藥特色治療卒中相關性肺炎是本課題研究的重點，本研究擬通過針刺結合中藥對SAP大鼠干預效應的實驗研究，為卒中相關性肺炎的臨床治療提供依據和思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取健康成年雄性SD大鼠120只，鼠齡10～12周，體重約250～280 g，大鼠均由安徽中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，合格證號：svxi-[(皖)2011-007]。所有大鼠均采用統(tǒng)一飼養(yǎng)，自由飲水和進食，飼養(yǎng)環(huán)境溫度控制在24～28 ℃之間，濕度在50%～60%，飲用滅菌自來水，房間要保持干凈、通風，定時清理鼠籠。實驗在安徽中醫(yī)藥大學動物實驗中心進行。

1.2 實驗藥物

頑痰湯藥液：陳皮、姜半夏、老鸛草、桃仁、碧桃干、全瓜蔞、苦杏仁、佛耳草、生地、川芎、炙甘草各10 g(頑痰湯為安徽中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院腦病一科治療肺部感染的經驗方)。以上中藥飲片的提供來自安徽中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院中草藥房。

藥液制備：將所有藥物飲片放入鍋內，加足量水浸過藥物，充分浸泡30 min后煎煮3次，濾出藥液，合并藥液后用水煎醇沉法制備原方提取液，濃縮藥液至含生藥0.82 g/mL，分裝后放置4 ℃冰箱中貯存?zhèn)溆茫o藥劑量參照標準動物的體表面積等效劑量折算系數法[6]算出大鼠灌胃等效計量為：8.2 g·kg-1·d-1，中藥組按46.0 g·kg-1·d-1的濃度灌胃。

1.3 主要實驗試劑及儀器

金黃色葡萄球菌標準菌株、MH(A)、MH(B)培養(yǎng)基購自蘇州北納創(chuàng)聯(lián)生物技術有限公司；腫瘤壞死因子TNF-α、白細胞介素IL-18酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒購自武漢基因美科技有限公司；移液器購自eppendorf公司；電熱恒溫箱購自上海三發(fā)；離心機購自安徽嘉文；電子天平購自梅特勒-托利多儀器上海有限公司；一次性針刺毫針(0.25 mm×30 mm)購自蘇州天協(xié)針灸器械有限公司。

2 實驗方法

2.1 實驗分組

選取健康雄性SD大鼠120只，隨機分為6組，即空白對照組、假手術組、模型組、針刺組、中藥組、針刺結合中藥組，每組各20只，空白對照組不作任何處理，假手術組只暴露頸總動脈，不阻斷血管，其他4組參照改良線栓法結合滴鼻法[7]接種0.2 mL金黃色葡萄球菌菌液制備SAP模型。

2.2 菌液配制

以0.9%生理鹽水配取菌懸液，用比濁儀將菌液濃度調節(jié)至1.0×108CFU/mL，并置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 制備SAP模型

2.3.1 腦卒中模型的制備和評價 采用參考文獻[8]中的線栓法建立大鼠的腦卒中模型。制備后采用Longa5分法[9]對大鼠進行神經功能缺損評分。0分：無神經損傷癥狀；1分：對側的前爪不能完全伸展；2分：向對側轉圈；3分：向對側傾倒；4分：不能自發(fā)行走，沒有意識；5分：死亡。評分在2～3分為腦卒中模型建立成功。

2.3.2 肺炎模型的制備 采用10%的水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔麻醉腦卒中模型成功的大鼠，將其以頭仰立位姿勢固定，經左側鼻腔逐滴緩慢滴入0.2 mL已配好的濃度為1×108cfu/mL金黃色葡萄球菌菌懸液(冰浴保存)，立即豎起大鼠，并將頭部向上垂直左右旋轉30 s，使菌液均勻分布于兩肺[10]。

2.3.3 腦卒中感染肺炎后的評價 感染72 h后觀察大鼠出現精神狀態(tài)差、進食減少、毛色灰暗、背部弓起、耳緣靜脈突起加粗，且呼吸急促，鼻唇部分泌液增多等癥狀。符合以上表現的大鼠則認為卒中相關性肺炎造模成功，不符合的將棄用。最終模型組和中藥組各有1只死亡，針刺組有2只死亡。

2.4 治療方法

將造模成功后的4組大鼠，稱取體重并記錄。空白對照組、假手術組、模型組不進行干預，同等條件下常規(guī)喂養(yǎng)。中藥組采用46.0 g·kg-1·d-1的劑量于每日上午9時左右進行灌胃(給藥前將藥液加溫至38 ℃左右)。針刺組自由飲水飲食，選取雙側大椎、列缺、尺澤、豐隆、太溪、足三里穴，穴位定位參照《實驗針灸學》[11]，皮膚和針具常規(guī)消毒，采用一次性0.25 mm×30 mm的毫針，選定穴位后快速進針，每次留針30 min，隔15 min行針1次，1次/天。針刺結合中藥組分別在針刺后予以中藥灌胃，方法同針刺和中藥組，每組連續(xù)治療7天。

2.5 標本采集及檢測方法

2.5.1 腫瘤壞死因子TNF-α、白細胞介素IL-18的檢測 治療7天后，禁食12 h，腹腔麻醉大鼠，將其以仰臥位固定在操作臺，剖腹，暴露腹主動脈，采用10 mL一次性注射器抽取動脈血8～10 mL，立即注入非抗凝采血管內，編號，在室溫下靜置2 h后離心(3 000 r/min)15 min，分離出血清并分裝保存在-20 ℃低溫冰箱待測。方法：按照TNF-α、IL-18 ELISA試劑盒的說明書檢測血清中TNF-α、IL-18炎性細胞因子水平。

2.5.2 肺組織含水量(濕重/干重)的測定 采血后開胸迅速取大鼠肺組織，用生理鹽水洗去殘血后分離出左右肺組織，右肺中葉用于測定肺組織含水量，將左肺大葉置于液氮罐中凍存待測MPO活性。方法：將切除的右肺中葉用濾紙吸干水后置于電子天平稱濕重(W)，隨后置于真空干燥箱內烘烤24 h后稱干重(D)，采用W/D比值表示肺組織含水量。

2.6 統(tǒng)計學方法

應用SPSS21. 0軟件對數據進行統(tǒng)計學分析，計量資料用均數加減標準差表示，兩組間比較用t檢驗，多組間比較用單因素方差分析，兩兩均數間比較用SNK-q檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 大鼠的一般狀態(tài)

干預7天后，空白對照組和假手術組的大鼠精神狀態(tài)良好，活動靈敏，毛發(fā)光澤，飲食正常，無明顯鼻周分泌物，呼吸平穩(wěn)，大便質軟；模型組大鼠出現動作緩慢、飲食減少，毛發(fā)干枯凌亂、鼻周見大量分泌物、呼吸喘促、大便質干。針刺組大鼠輕度萎靡，缺乏活力，飲食較少，鼻周見較多分泌物；中藥組大鼠狀態(tài)尚可，行動、飲食增加，無明顯毛發(fā)干枯、鼻周見少量分泌物；針刺結合中藥組大鼠精神狀態(tài)良好，活動、飲食明顯增加，無毛發(fā)干枯，未見鼻周分泌物，呼吸平穩(wěn)，大便質軟。

3.2 各組大鼠TNF-α、IL-18水平比較

干預7天后，與空白對照組比較，假手術組TNF-α、IL-18水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；模型組TNF-α、IL-18水平均明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，針刺組、中藥組、針刺結合中藥組TNF-α、IL-18水平均降低(P<0. 05)，但都高于空白對照組(P<0. 05)。與針刺組比較，中藥組TNF-α、IL-18水平差異具有統(tǒng)計學意義(P<0. 05)，針刺結合中藥組差異顯著(P<0. 01)。與中藥組比較，針刺結合中藥組TNF-α、IL-18水平降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0. 05)。見表1。

表1 各組治療后血清中TNF-α、IL-18炎癥因子水平比較

3.3 各組大鼠肺組織含水量(濕重/干重)比較

干預7天后，與空白對照組比較，假手術組W/D比值差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；模型組W/D比值顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，針刺組、中藥組、針刺結合中藥組W/D比值均降低(P<0. 05)，尤其針刺結合中藥組W/D比值顯著降低(P<0.01)。與針刺組比較，中藥組W/D比值差異具有統(tǒng)計學意義(P<0. 05)，針刺結合中藥組差異顯著(P<0. 01)。與中藥組比較，針刺結合中藥組W/D比值降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0. 05)。見表2。

表2 各組大鼠治療后肺組織含水量(W/D)的比較

4 討論

目前SAP的發(fā)病機制尚不明確，Meisel等[12]提出了中樞神經系統(tǒng)損傷誘導的免疫抑制綜合征(SIDS)，認為其可能是SAP發(fā)病的主要機制。腦卒中后發(fā)生的炎癥反應能清除壞死細胞以及促進組織愈合，但炎癥反應的過度能引起繼發(fā)性損害，SIDS不但能抑制炎癥反應，降低對腦組織的保護，還能降低機體對病原菌的抵抗力，進一步增加肺部感染的發(fā)生率[13]。TNF-α為一種多肽類細胞因子，由單核巨噬細胞分泌，在各種致炎因素的刺激或者機體處于應激狀態(tài)下，TNF-α在炎癥早期可大量釋放，促進T細胞產生各種促炎因子，進一步加重炎癥，從而對機體造成損傷[14]。IL-18是新近發(fā)現的具有多效能的炎癥細胞因子，可作為前炎癥因子誘導其他炎癥介質的釋放，促進T細胞增值及中性粒細胞的活化[15]。有研究證明[16]，IL-18能使白細胞在肺循環(huán)發(fā)生黏附聚集，引起TNF-α等炎性細胞因子釋放，造成大鼠肺部炎癥損傷并導致呼吸功能下降。

腦卒中早期易引起肺損傷，肺組織會出現肺泡結構變化、水腫及炎性浸潤等典型病理特征[17]。本研究通過改良線栓法結合滴鼻法建立SAP模型，結果發(fā)現模型組大鼠肺組織出現腫脹、彌漫性充血、出血等符合肺組織損傷的表現，通過測定大鼠肺組織W/D值以及血清中的TNF-α、IL-18炎癥因子水平，發(fā)現呈不同程度的升高，進一步表明肺組織出現炎性細胞浸潤，由此認為SAP模型制備成功。在針刺、中藥治療后，結果顯示，與模型組對比，各干預治療組大鼠的一般狀態(tài)均有一定的改善，其中W/D值、TNF-α、IL-18水平均呈現不同程度的降低，說明針刺以及中藥干預可以有效減輕肺間質水腫和改善肺部炎癥反應，從而促進肺功能的恢復。

SAP在中醫(yī)學可歸屬于“咳嗽”“喘證”等范疇，其病理因素多為痰、虛，病因病機多為中風后機體陰陽失調，脾胃虛弱，氣化不利，導致痰濕內生，易停留肺，使肺氣不宣，而致咳嗽，且痰濕郁肺日久可化為痰火，痰熱內擾，壅阻于肺，則出現咳嗽、痰黃質稠等癥狀，演變成痰熱郁肺之證[18]，故治療上采用清熱化痰之法，且肺與大腸相表里，肺氣不宣，則腑氣不通，出現大便秘結；中風后多伴有肢體活動不利，日久則氣虛血瘀，治療上要兼顧行氣活血通絡、潤腸通便。目前有研究證實[19]，葦莖湯合麻杏石甘湯能明顯改善SAP痰熱蘊肺證患者的炎癥損傷、心肺功能，提高其免疫功能。本研究采用自擬方頑痰湯治療SAP，此方由陳皮、姜半夏、老鸛草、桃仁、碧桃干、全瓜蔞、苦杏仁、佛耳草、生地、川芎、炙甘草組成，其中陳皮、姜半夏相互配伍共達健脾燥濕化痰之效；老鸛草祛風通絡、活血化瘀；桃仁活血化瘀、止咳平喘，碧桃干、川芎與桃仁配伍加強活血止痛之效；全瓜蔞清熱滌痰、潤燥滑腸；苦杏仁與佛耳草配伍止咳平喘之效更佳；生地滋陰清熱涼血；炙甘草補脾和胃、止咳平喘，諸藥合用，共奏清熱化痰、行氣活血通絡、潤腸通便之效。此次結果顯示，與模型組和針刺組比較，中藥組W/D值、TNF-α、IL-18水平呈現不同程度的降低(P>0.05)，尤其針刺結合中藥組降低顯著(P<0.01)，說明頑痰湯能有效減輕肺組織炎癥損傷。

針刺療法以經絡腧穴為理論依據，有疏通經絡，調節(jié)氣血，平衡陰陽之用。研究[20]證實，將肺俞、合谷、列缺作為主穴的針刺療法治療SAP有顯著的臨床效果。本研究選取大椎、列缺、尺澤、足三里、豐隆、太溪穴為針刺治療穴位。大椎屬督脈穴，解表泄熱、通督行氣；列缺為手太陰肺經的絡穴，解表宣肺、通經活絡；尺澤為肺經的合穴，清解肺熱；足三里為足陽明胃經的合穴，調理氣血、祛邪扶正；豐隆屬足陽明胃經，為治痰要穴，加強祛痰之效；太溪為足少陰腎經的原穴，滋陰益腎，以上穴位相互配伍以達清熱燥濕化痰、通經活絡之效。此次結果顯示，與模型組比較，針刺組的W/D值、TNF-α、IL-18水平均呈現不同程度的降低(P<0.05)，說明針刺治療可以有效改善SAP大鼠的肺損傷。李俠等[21]研究發(fā)現，針刺結合瀉肺化痰方對改善SAP患者的臨床癥狀及促進神經功能康復有相對的優(yōu)勢。通過本研究發(fā)現，針刺結合中藥組與其余各干預組比較差異顯著(P<0.05)，說明針刺結合中藥療效優(yōu)于單用針刺或中藥治療，能有效減輕SAP大鼠的肺組織炎癥反應。

綜上所述，針刺結合中藥治療卒中相關性肺炎大鼠有一定療效，可以有效改善肺組織水腫、降低肺組織的TNF-α、IL-18炎性細胞因子水平，這可能為其減輕SAP肺組織損傷的機制之一，并且能為臨床上治療卒中相關性肺炎提供依據和優(yōu)化方案。