溫度對中華倒刺鲃不同生理生態性能的影響：馴化有益假說的驗證

黃 艷,彭敏銳,夏繼剛

進化生理與行為學實驗室,重慶市動物生物學重點實驗室,重慶師范大學生命科學學院, 重慶 401331

表型可塑性是自然選擇和進化的基礎,它不僅是生物表型的基本屬性,而且存在于動物整個生活史進程[1- 3]。溫度是動物棲息地環境最重要的非生物因子之一,溫度對動物生理功能和生態學過程的影響是動物生理生態學領域的核心問題[4- 6]。熱馴化是指動物調整自身的生理機能與行為表現以適應外界環境溫度的變化,是動物表型塑造的一個特殊過程[7- 8]。開展熱馴化對適合度密切相關的表型特征的研究有助于豐富動物溫度適應性進化的理論內涵。目前,有關熱馴化對外溫動物適合度的影響尚有爭議,主要涉及如下幾個假說：(1)馴化有益假說(Beneficial acclimation hypothesis)認為,生物表型的適應性變化會增強其在誘導這些變化產生的環境中的生理機能或適合度,例如,經過特定溫度馴化的動物,其運動能力或適合度與其他溫度下生存的個體(在該溫度下)相比有所提高,即動物的運動能力對馴化溫度具有補償性反應[9- 11]；(2)熱有益假說(Warmer is better hypothesis)和(3)冷有益假說(Cooler is better hypothesis)則分別認為,高溫/低溫下馴養的動物與其他溫度下馴養的動物相比(在各種溫度下)具有更好的行為表現或適合度[10]；(4)最佳發育溫度假說(Optimal developmental temperature hypothesis)認為,最佳環境溫度下發育的動物與其他溫度下發育的動物相比(在各種溫度下)均具有更好的生理機能與行為表現[12]；(5)無益假說(No-advantage hypothesis)認為,在動物正常活動的溫度范圍內,馴化溫度對動物的行為表現無影響[7]。在以上各假說中,以馴化有益假說最具影響力,然而,盡管該假說獲得了一些實驗數據的支持,但其普適性一直存在較大爭議[13- 15]。

運動是動物最為重要的生理活動之一,通常作為重要的功能性狀被用于熱生態學研究和馴化有益假說的驗證[11]。游泳運動作為絕大多數魚類重要的生存活動方式,是其實現逃逸、捕食、繁殖等多種行為功能及生態學過程的基礎,與動物適合度密切相關[16- 17]。然而,魚類為實現不同生理活動所采用的游泳方式不同。其中,穩定游泳主要存在于搜索食物和配偶、尋找適宜生境、生殖洄游等生理活動方面,由有氧代謝提供能量,與呼吸能力、組織有氧代謝能力、紅肌的結構及相對比例等有關[18- 19]；而非穩定游泳主要存在于捕食獵物/逃避捕食者、穿越復雜生境等生態表現方面,由無氧代謝提供能量,與無氧代謝能力、白肌的結構等有關[20- 21]。盡管穩定和非穩定游泳能力對魚類生存繁衍均至關重要,然而,由于二者對機體形態以及生理生化等多方面存在相悖的需求,故而在適應性進化上可能存在多方面的限制與權衡[22- 23]。鑒于溫度馴化對魚類不同生理生態性能的影響可能不一致,那么,研究參數體系選擇對熱馴化相關假說的驗證就尤為關鍵；因此,整合表征機體生存適合度的不同生理生態性能,進而揭示魚類表型特征對熱馴化的響應模式是必要的。為此,本研究以我國長江中上游廣泛分布的中華倒刺鲃(Spinibarbussinensis)為對象,分別考察了馴化溫度(18℃、28℃)和測試溫度(18℃、28℃)及其交互作用對該物種有氧運動能力和無氧運動能力的影響,為馴化有益假說等相關假說的驗證提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗魚((2.90±0.10) g,(5.71±0.0) cm,n=60)購于重慶合川水產學校,置于實驗室自凈化循環控溫水槽(1.2 m×0.55 m×0.55 m,實際水量250 L)中馴養適應2周。適應期間,實驗用水為曝氣后的自來水,保證水體溶氧≥90%飽和溶氧,水溫(23±0.1)℃,日換水量約為馴養水體的10%,光周期15 L: 9 d；每日投喂1次冰凍紅蟲,投喂15 min后用虹吸管清除殘餌及糞便。

1.2 實驗方案

適應結束后,將實驗魚隨機分為兩組,將水溫從23℃開始分別以1℃/d的速率升溫至28℃或降溫至18℃(28℃和18℃分別接近實驗魚棲息地在夏季、春秋季的平均溫度,均未超過實驗魚的適宜溫度范圍[24]),然后將實驗魚分別在各自的目標溫度下(18℃、28℃)馴化2周(溫度馴化處理)。將經過不同溫度馴化處理的實驗魚禁食24 h,然后分別在不同的測試溫度下(18℃、28℃)(測試溫度處理)測定其無氧運動能力,之后,將實驗魚放回原有的溫度馴化環境恢復24 h再進行有氧運動能力測定,最后分析馴化溫度(18℃、28℃)和測試溫度(18℃、28℃)及其交互作用對實驗魚不同生理生態性能的影響。溫度馴化期間,除了水溫不同外,其余水質環境條件以及喂養水平等與馴養適應期間保持一致。測試期間,水溫精度控制在±0.1℃。各組測試樣本量均為n=15。

1.3 無氧運動能力測定

采用魚類快速啟動游泳能力(Fast-start performance)測定系統進行測定[23,25],該系統主要包括一個方形實驗缸(長×寬×高, 40 cm×40 cm×15 cm；實驗缸底部的透明有機玻璃板上刻有1 cm×1 cm的網格線)、一個位于水槽正下方30 cm處的LED矩陣光源以及一個LED電脈沖指示燈等。將直徑1 mm的白色小塑料球固定在實驗魚背部中央皮膚表層,作為實驗魚的質心標記,然后將單尾實驗魚轉入測試系統,并給予5 min的適應期以消除轉移脅迫。測試水體水深8 cm,溶解氧≥90%飽和溶氧。實驗魚的快速啟動逃逸行為由電脈沖刺激所激發(電刺激場強：0.75 v/cm,刺激時長：50 ms)。在發送電脈沖刺激的同時,用高速攝影機(500幀/s, BASLER A504K, Germany)開始拍攝記錄實驗魚的整個逃逸過程,拍攝歷時2 s。LED指示燈電源與刺激電源并聯,可以通過攝像機捕獲的圖像確定刺激起始時刻。

采用圖像處理軟件(nEO iMAGING和ACDsee 12)對拍攝的圖像進行處理,采用軟件TpsUtil和TpsDig(http://life.bio.sunysb.edu/morph/)將圖像數字化以測量實驗魚質心位移,依據質心軌跡計算出反應時滯(Latency time,TLatency)、最大線速度(Maximum linear velocity,Vmax)、最大加速度(Maximum linear acceleration,Amax)以及刺激起始120 ms內質心移動位移(Escape distance during the first 120 ms after the stimulus,S120ms)等參數。

1.4 有氧運動能力測定

1.4.1臨界游泳速度(Critical swimming speed,Ucrit)

采用魚類游泳代謝儀測定Ucrit[26]。測定時,將單尾實驗魚放入游泳管中適應20 min以使其適應微水流環境(6 cm/s,約為每秒一倍體長)。之后,將水流從6 cm/s開始,每隔20 min提升一次流速(流速增量為6 cm/s)并換水1次以確保游泳管內的水體溶氧不低于初始水平的80%,直至實驗魚到達力竭狀態。力竭狀態的判定標準是實驗魚停留在游泳管末端篩板20 s以上[26]。Ucrit的計算公式如下：

Ucrit=U+ (t/T)ΔU

式中,Ucrit為臨界游泳速度,U為完成設定時間(20 min)游泳所游過的最大速度,ΔU為速度增量(6 cm/s),T是在各速度梯度下設定的持續游泳歷時(20 min),t為出現力竭狀態的速度下的實際游泳時間。

1.4.2運動代謝率

在Ucrit測定過程中,使用溶氧儀(HQ30, Hach Company, Loveland, CO, USA)對游泳管內水體的溶氧水平進行測定,每2 min測定1次,得出實驗魚的運動代謝率(Active metabolic rate,MO2)(mg O2kg-1h-1)。MO2的計算公式如下：

MO2=60 (S-S0)V/m

式中,S、S0分別為游泳管內水體在有實驗魚和無魚(細菌耗氧)狀況下的溶氧水平隨時間變化斜率的絕對值,V為游泳管水體系統總體積(3.5 L)減去實驗魚所占的體積,m為實驗魚的體重(kg)。

中國的改革開放體現的實踐的偉大之處在于它一方面繼承著中國發展而來的歷史經驗，另一方面創新著中國發展出去的民族精神。習近平總書記在慶祝改革開放40周年大會指出： “只有順應歷史潮流，積極應變，主動求變，才能與時代同行。”[1]新時代的具體實踐方案體現的就是中國的發展思路、中國的戰略定位、中國的世界眼光，實踐方案關系著改革開放能否順利的承接歷史使命，關系著中華民族的前途命運。我們還應該在偉大實踐的新時代方案中不斷深化改革開放的政治意義、時代意義、民族意義。

將Ucrit測定過程中測得的最大MO2記為最大代謝率(Maximum metabolic rate, MMR)[23]。

1.4.3游泳效率

通過測定游泳運動單位距離能量消耗(The energetic cost of transport, COT)來反映游泳效率,COT(J/m)越大則游泳效率越低[19, 26]。COT的計算公式如下：

COT=13.56MO2/(U×36)

式中,MO2為不同游泳速度U下的耗氧率,13.56為氧熱當量系數(J/mg O2)[27]。

1.5 數據分析

采用SPSS軟件(SPSS 19.0 Inc., USA)對數據進行統計分析。首先對實驗數據進行正態性(Shapiro-Wilks檢驗)和方差齊性檢驗。采用雙因素方差分析和Tukey′s HSD多重比較檢驗馴化溫度和測試溫度對實驗魚有氧運動能力(Ucrit、MMR)和快速啟動能力(TLatency、Vmax、Amax、S120 ms)的影響,采用三因素方差分析檢驗馴化溫度、測試溫度、游泳速度(水流速度)對運動代謝率MO2和COT的影響。數據均以平均值±標準誤表示,顯著性水平設為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 溫度對實驗魚無氧運動能力的影響

除Amax外,馴化溫度對TLatency、Vmax、S120 ms均無顯著影響(P>0.05,表1,圖1),結果傾向于支持無益假說。測試溫度對TLatency、Amax、S120 ms的影響顯著(P<0.05,表1)。無論馴化溫度如何,28℃測試環境下TLatency均較短,S120 ms均較長(P<0.05)；28℃馴化—28℃測試下的Amax優于18℃馴化—28℃測試下的Amax(P<0.05,圖1),該數據部分支持馴化有益假說。

2.2 溫度對實驗魚有氧運動能力的影響

馴化溫度、測試溫度及其交互作用對實驗魚Ucrit的影響顯著(P<0.05,表1)。18℃馴化—18℃測試下的Ucrit優于28℃馴化—18℃測試下的Ucrit(P<0.05),結果支持馴化有益假說和冷有益假說；然而28℃馴化—28℃測試下的Ucrit與18℃馴化—28℃測試下的Ucrit相比無顯著差異(P>0.05,圖2),結果又不支持前述假說。

馴化溫度和測試溫度對實驗魚MMR均有顯著影響(P<0.05,表1)。18℃馴化—18℃測試下的MMR優于28℃馴化—18℃測試下的MMR(P<0.05),結果支持馴化有益假說和冷有益假說；然而28℃馴化—28℃測試下的MMR也低于18℃馴化—28℃測試下的MMR(P<0.05,圖2),結果僅支持冷有益假說。

2.3 溫度對實驗魚運動代謝率和游泳效率的影響

馴化溫度、測試溫度、游泳速度對實驗魚的運動代謝率MO2影響顯著(P<0.05,表1)。當游泳速度小于30 cm/s時,馴化溫度對MO2無影響,結果支持無益假說(P>0.05)；而當游泳速度大于30 cm/s時,在特定的流速下經28℃馴化的實驗魚無論在28℃還是18℃的測試環境下MO2均較低(P<0.05,圖3),結果支持熱有益假說。

表1 馴化溫度和測試溫度對中華倒刺鲃生理生態參數的影響

圖1 馴化溫度和測試溫度對中華倒刺鲃Vmax、Amax、TLatency、和S120 ms的影響Fig.1 The effects of acclimation temperature and test temperature on Vmax, Amax, TLatency and S120 ms in Spinibarbus sinensisVmax: 最大線速度 Maximum linear velocity; Amax: 最大加速度 Maximum linear acceleration; TLatency: 反應時滯 Latency time; S120 ms: 刺激起始120 ms內質心移動位移 Escape distance during the first 120 ms after the stimulus;*表示同一測試溫度下不同溫度馴化組間差異顯著(P<0.05)；a, b上標字母不同表示18℃馴化的實驗魚在不同測試溫度下差異顯著(P<0.05)；x, y上標字母不同表示28℃馴化的實驗魚在不同測試溫度下差異顯著(P<0.05)

圖2 馴化溫度和測試溫度對中華倒刺鲃Ucrit和MMR的影響Fig.2 The effects of acclimation temperature and test temperature on Ucrit and MMR in Spinibarbus sinensisUcrit: 臨界游泳速度 Critical swimming speed; MMR: 最大代謝率 Maximum metabolic rate; *表示同一測試溫度下不同溫度馴化組間差異顯著(P<0.05)；a, b上標字母不同表示18℃馴化的實驗魚在不同測試溫度下差異顯著(P<0.05)；x, y上標字母不同表示28℃馴化的實驗魚在不同測試溫度下差異顯著(P<0.05)

類似地,馴化溫度、測試溫度、游泳速度對實驗魚運動單位距離能耗COT影響顯著(P<0.05,表1)。當游泳速度小于30 cm/s時,馴化溫度對COT無影響(P>0.05,圖3),結果支持無益假說；而當游泳速度大于30 cm/s時,在特定流速下經28℃馴化的實驗魚無論在28℃還是18℃的測試環境下COT均較低(P<0.05,圖3),結果支持熱有益假說。

圖3 馴化溫度、測試溫度和游泳速度對中華倒刺鲃MO2和COT的影響Fig.3 The effects of acclimation temperature, test temperature and swimming speed on MO2 and COT in Spinibarbus sinensisMO2: 運動代謝率 Active metabolic rate; COT: 單位距離能耗 The energetic cost of transport; #表示在特定水流速度和同一測試溫度下不同溫度馴化組間差異顯著(P<0.05)

3 討論

多數硬骨魚類經常暴露在溫度變化的水環境中,這種溫度變化一般分為急性溫度變化(例如潮汐、遷移)和慢性溫度變化(例如季節變換、晝夜節律)[28-30]。伴隨著溫度波動,魚體生理機能及其生態表現的可塑性將決定其能否在極端溫度條件下生存,這一特性是魚類應對溫度急性/慢性變化的關鍵因素[31- 34]。

通常情況下,與遭遇環境驟然變化的動物相比,經歷相同或相似環境馴化的動物具有充足的時間調整自身的生理、形態和行為,以使其能夠在該環境中能更好地生存[10- 11,31]。馴化有益假說正是基于這一背景提出的,并在一系列實驗中進行了檢驗。李曉晨等[35]發現,22℃馴化—22℃測試下的胡氏大生熊蟲(Macrobiotushufelandi)運動時間比、運動速度顯著大于2℃—22℃測試下的動物,但2℃馴化—2℃測試下的動物與22℃馴化—2℃測試下動物的運動表現相比無顯著差異,結果部分支持馴化有益假說；該研究同時還發現,任何偏離馴化溫度的實驗溫度都會造成表征動物適合度的運動速率的下降。Geister等[36]探究了不同測試溫度(27℃、20℃)條件下,發育溫度(27℃、20℃)和馴化溫度(27℃、20℃)對叢林斜眼褐蝶(Bicyclusanynana)交配成功率的影響,結果發現在20℃測試環境下經歷20℃馴化的動物的表現遠遠優于其他個體,然而在27℃測試環境下并非所有經歷27℃馴化的個體的表現均優于經歷20℃馴化的個體(僅經歷20℃發育27℃馴化的個體更具優勢),結果部分支持馴化有益假說。此外,陸洪良等[37]發現,經25℃馴化的東方蠑螈(Cynopsorientalis)在25℃測試溫度游泳速度最大,15℃和20℃下馴化的蠑螈在對應的測試溫度下游泳速度亦稍大,表明經特定溫度馴化的動物在該溫度下具有增強的功能表現和適合度,結果總體上支持馴化有益假說。

一般認為,表型的馴化適應性變化能提高有機體(在誘導表型響應發生環境下)的生理機能或適合度,但在確定馴化對表型變化產生的功能作用方面時,對馴化現象往往又產生一些爭論,包括表型如何提高生理功能、行為表現、生長、繁殖以及存活等[10, 35, 38]。不僅如此,機體不同器官和組織對馴化環境的響應與適應時間也很可能存在差異[39- 40],例如,經過快速降溫后,中華倒刺鲃的低溫耐受和高溫耐受能力分別于降溫的1—2周達到穩定,而游泳運動能力在4周達到穩定,消化功能可在短期(1周內)得以調整穩定[40]。因此,合適的表型性狀的選擇對馴化有益假說檢驗至關重要[41- 42]。值得注意的是,以往的研究往往局限于用生物某一方面甚至是某一個表型來對馴化有益假說進行驗證,所得出的結論很可能具有片面性。本研究整合魚類的不同生理生態性能驗證馴化有益假說(而且這些不同的生理生態性能之間本身又存在著相悖的進化需求),研究結果并非簡單的支持或否定馴化有益假說。研究發現,中華倒刺鲃不同生理生態性能對溫度馴化的響應存在差異。總體上,馴化溫度對表征中華倒刺鲃無氧運動能力的快速啟動游泳無顯著影響(除Amax外),但對表征中華倒刺鲃有氧運動能力的Ucrit和MMR影響顯著,并且顯著影響中華倒刺鲃的運動代謝率MO2以及運動單位距離能耗COT。其一,快速啟動能力受馴化溫度影響不顯著,而受測試溫度影響顯著,暗示中華倒刺鲃無氧運動能力可對環境溫度變化產生快速的響應與適應,該結果傾向于支持熱馴化的無益假說。其二,動物有氧運動關聯的生理機能對熱馴化的響應與調整通常涉及到酶系統的改變、代謝底物積累、膜結構調整、熱休克蛋白表達的變化等[29,43]。當動物遭遇環境的驟然變化時,其生理功能的調整往往難以在短時間內完成。與無氧運動能力對馴化溫度的響應相比,本研究中,馴化溫度和測試溫度對表征中華倒刺鲃有氧運動能力的Ucrit和MMR均影響顯著。18℃馴化—18℃測試下的Ucrit和MMR均優于28℃馴化—18℃測試下的Ucrit和MMR,然而,28℃馴化—28℃測試下的Ucrit和MMR并不高于18℃馴化—28℃測試下的Ucrit和MMR,該結果部分支持馴化有益假說和冷有益假說。其三,馴化溫度、測試溫度和游泳速度對中華倒刺鲃運動代謝率MO2和COT影響顯著。有趣的是,當游泳速度小于30 cm/s時,馴化溫度對MO2和COT無影響,結果支持無益假說；而當游泳速度大于30 cm/s時,在特定的流速下經過28℃馴化的中華倒刺鲃無論是在28℃還是18℃的測試環境下MO2和COT均較低,結果又傾向于支持熱有益假說,本研究結果同時表明馴化有益相關假說的驗證還與測試對象所處的環境壓力及其強度有關。其四,對游泳能力(Ucrit和MMR)的測試結果部分支持馴化有益假說和冷有益假說,而在高流速下對游泳效率(COT)檢測結果傾向于支持熱有益假說,暗示急性溫度變動下實驗魚的游泳能力與游泳效率變化具有非同步性,急性溫度升高可能對實驗魚具有更大的“興奮刺激”作用引起更強的急性應激反應[30]。

綜上,本研究發現中華倒刺鲃不同生理生態性能對溫度馴化的響應不一致,并分別支持不同的假說。由于機體不同器官和組織對馴化環境的響應與適應時間存在差異,因此合適的表型性狀的選擇對馴化有益假說的檢驗尤為關鍵,加之不同測試環境壓力下動物生理功能(例如MO2和COT)對熱馴化的響應又表現出相異的規律,未來研究中選取切實有效的整體功能性狀(例如,優質生境占有率、捕食成功率、食物和配偶資源占有率等)[42],進而揭示魚類表型對熱馴化的響應模式是必要的。研究提示：馴化有益假說并不具有普遍性,熱馴化相關假說的驗證不僅受表型性狀選擇的影響,而且還與測試的環境選擇壓力有關。