長翅熊蜂雄性蜂下唇腺分泌物特性分析

（中國農業科學院蜜蜂研究所，農業農村部授粉昆蟲生物學重點實驗室，北京 100093）

1 引言

頭部下唇腺分泌物（cephalic labial gland secretions，CLGS）是雄性蜂頭部下唇腺分泌的標記性信息素，具有物種特異性，其在蜂王和雄性蜂交尾前的相互識別過程中起重要作用[1]。在自然狀態下，熊蜂交尾前的化學通訊行為主要包括巡邏式飛行和氣味標記兩種方式[2]。雄性蜂通過頭部分泌性外激素并將其標記在沿途的花葉、樹枝和草莖上，引誘同種雄性蜂和新蜂王產生一定的行為或生理效應，其作用是協助完成交尾或促進種間生殖隔離[3]。因此，開展熊蜂的下唇腺分泌物揮發性成分分析，有助于了解熊蜂的化學通訊。

熊蜂的雄性蜂下唇腺分泌物成分主要為脂肪族化合物[4]。不同熊蜂種之間，親緣關系較近的雄性蜂下唇腺分泌物成分比較接近。近年來已有文獻報道了我國9 種本土熊蜂雄性蜂下唇腺分泌物成分，分別為：親熊蜂Bombus consobrinus、韓熊蜂B.coreanus、火紅熊蜂B.pyrosoma、紅光熊蜂B.ignitus、烏蘇里熊蜂B.ussurensis、新疆地熊蜂B.terrestrisXJ、短頭熊蜂B.breviceps、紅尾熊蜂B.haemorrhoidalis和蘭州熊蜂B.lantschouensis[5]。Bertsch 等分別對來自中國和歐洲的明亮熊蜂B.lucorum雄性蜂下唇腺分泌物揮發性成分進行了分析[6]。

長翅熊蜂B.longipennis主要分布在我國青藏高原及周邊地區，對高海拔地區的高寒、低氧等極端環境條件具有較強的適應能力，對維持該地區植物的傳粉具有重要作用[7-9]。同時，長翅熊蜂也是獨具代表性的熊蜂復合種之一，在形態上和地熊蜂、明亮熊蜂、隱熊蜂等幾種熊蜂極為相似[10]。本研究利用氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）和氣相色譜（GC）技術對我國長翅熊蜂雄性蜂下唇腺分泌物進行定性和定量分析，明確其揮發性成分的種類和含量。該研究為進一步探究長翅熊蜂交尾行為的信息交流提供基礎數據，同時，也作為一種輔助手段為熊蜂物種鑒定提供依據。

2 材料與方法

2.1 材料

長翅熊蜂雄性蜂新鮮樣本采集于2019年中國農業科學院蜜蜂研究所熊蜂飼養室，在不同蜂群內隨機采集雄性蜂共6 頭，采集后迅速凍于液氮。用干凈的鑷子切取頭部置于400μl 正己烷浸泡，室溫萃取24h，保存于-20℃冰箱備用。測定前，將樣品從冰箱取出置于冰上，移取100μl 萃取液用于氣相色譜測定。

2.2 方法

2.2.1 氣相色譜-質譜聯用分析

使用Agilent 7200 氣相色譜-四級桿飛行時間質譜聯用儀（Q-TOF GC/MS）對分泌物中的揮發性成分進行定性分析。為避免主峰強度過高出現飽和現象，進樣前將樣品溶液稀釋100 倍后，再進樣分析。

氣相色譜-質譜聯用分析條件：色譜柱Agilent HP-5MS（30m×0.25mm×0.25μm）；進樣量1μl；分流比：5∶1 或80∶1；EI離子源；電離能量：70eV；質譜掃描方式：全掃描；傳輸線溫度：280℃；升溫程序：初始溫度70℃，保持1min；以15℃/min 速率升至160℃，保持3min；以10℃/min速率升至190℃；以3℃/min 速率升至225℃，保持5min；以15℃/min 速率升至300℃，保持3min。

2.2.2 氣相色譜分析

使用Agilent 7890A 氣相色譜儀（GC-FID）對分泌物中的揮發性成分進行定量分析。氣相色譜分析條件：色譜柱Agilent DB-5MS（30m×0.25mm×0.25μm）；載氣：高純氮氣（99.999%）；氣體流速1ml/min；進樣量1μl；不分流模式；升溫程序：初始溫度70℃，保持1min；以15℃/min 速率升至170℃，保持2min；以10℃/min 速率升至190℃；以3℃/min速率升至225℃，保持5min；以15℃/min 速率升至300℃，保持1min。

2.3 數據分析

使用Agilent MassHunter Unknowns Analysis 軟件對雄性蜂頭部下唇腺分泌物揮發性成分進行定性分析，通過解卷積方式自動檢索譜庫（National Institute of Standards and Technology，NIST 14）識別未知化合物，參數設置為默認。同時，為進一步確保化合物鑒定的準確性，使用Agilent MassHunter Qualitative Analysis B.07.00 軟件，手動逐一選擇色譜峰，提取質譜圖，扣除本底后檢索譜庫鑒定未知化合物。在兩種方式的定性結果存在分歧時，優先選擇后者。

揮發性成分的相對含量是由各化合物峰面積與總峰面積的比值計算得出，同時，對雄性蜂下唇腺分泌物揮發性成分氣相數據進行優化，剔除相對含量小于0.1%的色譜峰。

3 結果

利用GC-MS 對長翅熊蜂雄性蜂頭部下唇腺分泌物揮發性成分進行鑒定（圖1），結果表明，共有28種揮發性成分，包括10 種醇類、8 種酯類、3 種烯烴類、3 種烷烴類、1 種醛類和3 種未知化合物。其中醇類化合物含量最高，平均相對含量為59.06%，其次為酯類化合物，含量為17.97%（表1）。

圖1 長翅熊蜂下唇腺分泌物揮發性成分氣相色譜圖

利用GC 對長翅熊蜂雄性蜂頭部下唇腺分泌物揮發性成分進行定量分析，結果表明，3,7,11-三甲基-6,10-十二碳二烯-1-醇含量最高，是長翅熊蜂雄性蜂下唇腺分泌物中的主要成分，平均相對含量為38.45±3.68%。除此之外，9,12,15-十八碳三烯-1-醇、9,12-十四碳二烯-1-醇乙酸酯和二十八烷這3種揮發性成分的含量也較高，平均相對含量分別為11.36±0.61%、9.88±1.40%和13.31±2.19%。二十碳烯醇（3.94±0.34%）、13-二十二烯醇（1.79±0.18%）、月桂酸乙酯（2.74±1.58%）、十二酸-1-甲基乙基酯（2.71±0.64%）、十四醛（1.80±0.20%）、正二十一烷（3.29±0.28%）和三十一烷（1.50±0.47%）含量次之，平均相對含量在1%～5%。共有17 種揮發性成分含量較少，平均相對含量在0.3%～1%，分別為：1-二十醇、二十碳烯醇、藍桉醇、正十六烷醇、5,8,11-十七碳三烯-1-醇、二十七烷醇、乙酸法呢醇酯、十七碳三烯酸甲酯、油酸乙酯、十八酸乙酯、碳酸異丁酯、1,7-十六烷二烯、十七碳-1,8,11-三烯、十七碳-1,8,11,14-四烯和3 種未知組分（表1）。

表1 長翅熊蜂頭部下唇腺分泌物揮發性成分種類及相對含量

4 討論

熊蜂雄性蜂性信息素是由雄性蜂頭部下唇腺分泌的一種揮發性成分，作為一種化學通訊信號，在蜂王和雄性蜂交尾前識別過程中發揮著重要作用。本研究采用氣相色譜-質譜聯用和氣相色譜技術對廣泛分布于我國青藏高原地區的長翅熊蜂雄性蜂下唇腺分泌物中的揮發性成分進行鑒定及相對含量的測定，明確其化合物種類和含量。該研究結果為深入探究熊蜂交尾前化學通訊機理提供基礎數據，也為熊蜂鑒定提供依據。

2011年，Bertsch 等分別對來自中國和歐洲的明亮熊蜂雄性蜂下唇腺分泌物成分進行了分析，基于分子數據和化學鑒定結果認為中國明亮熊蜂應為長翅熊蜂[6]。此外，該研究結果表明，長翅熊蜂下唇腺分泌物的主要成分為月桂酸乙酯，相對含量為31%，其次為3,7,11-三甲基-6,10-十二碳二烯-1-醇，相對含量為24%，以及油酸乙酯，相對含量為15%。在本研究中，6 頭雄性蜂下唇腺分泌物也都檢測到月桂酸乙酯，但其相對含量范圍在1.02%～5.78%，并不能作為分泌物中的主要成分，與前人結果存在較大差異。另外，在Bertsch 等人的研究中，3,7,11-三甲基-6,10-十二碳二烯-1-醇（24%）是含量僅次于月桂酸乙酯的揮發性成分，但我們的研究結果表明3,7,11-三甲基-6,10-十二碳二烯-1-醇是長翅熊蜂雄性蜂下唇腺分泌物中的主要成分，其相對含量范圍高達32.22%～43.54%，造成這些差異的原因可能是由于雄性蜂的年齡差異。研究表明，不同年齡段的雄性蜂，下唇腺分泌物中主要成分的含量會發生變化，但種內差異仍低于種間差異[11]。熊蜂雄性蜂下唇腺分泌物的成分和含量與粗面內質網、高爾基體和滑面內質網的數量有關，在年輕的個體中（小于1日齡的雄性蜂），粗面內質網是主要的分泌器官；對于1日齡雄性蜂，高爾基體是主要的分泌器官；大于2日齡的雄性蜂，滑面內質網是主要的分泌器官[12]。

雄性蜂下唇腺分泌物揮發性成分作為蜂王和雄性蜂交尾前的識別信號，其種類和含量在一定范圍內存在較大的可變性。由于年齡、地理環境、采集時間、樣本處理和儀器設備的不同，不同實驗室的鑒定結果可能會存在一定差異。但即便是同分異構體之間的微小差異也可能在熊蜂交尾前的化學通訊中起關鍵作用，需要更多的樣本和研究進一步驗證[13]。本研究采用氣相色譜-高分辨四級桿飛行時間質譜聯用儀，通過精確質量數檢索譜庫鑒定化合物，與前人研究結果進行比較驗證，以期明確下唇腺分泌物中穩定存在的揮發性成分。研究結果表明，在6 頭長翅熊蜂雄性蜂頭部下唇腺分泌物中含量比較高（平均相對含量＞1%）的成分共11 種，與Bertsch 等人研究中相對含量同樣大于1%的10 種物質成分進行比較，共發現4種揮發性成分的鑒定結果完全一致，分別為：3,7,11-三甲基-6,10-十二碳二烯-1-醇、9,12,15-十八碳三烯-1-醇、月桂酸乙酯和十四醛[6]。我們認為，這4種揮發性成分穩定存在于長翅熊蜂下唇腺分泌物中，在長翅熊蜂蜂王和雄性蜂交尾前識別過程中可能發揮重要作用，其化學通訊機理有待進一步探究。

本研究報道了我國長翅熊蜂雄性蜂下唇腺分泌物的28 種揮發性成分，并明確其相對含量。熊蜂下唇腺分泌物主要揮發性成分在其交尾前相互識別過程中起著重要作用，故本研究對于長翅熊蜂主要揮發性成分在熊蜂交尾行為的化學通訊功能還有待進一步驗證。此外，雄性蜂下唇腺分泌物中相對含量較低的揮發性成分也可能是熊蜂雄性蜂和蜂王交尾前化學通訊的關鍵物質，因此，探究這些微量成分在熊蜂化學通訊中扮演的角色也是今后重要的研究方向。