LRRC1通過DLG1/YAP信號通路促進肝癌細胞增殖的研究

奚小荔?周浩雄?楊碧蘭?吳斌?楊逸冬

【摘要】目的 研究富含亮氨酸的重復序列蛋白1（LRRC1）通過巨盤狀蛋白1（DLG1）/Yes相關蛋白（YAP）信號通路調節肝癌細胞增殖的機制。方法 在原發性肝細胞癌患者的癌灶組織及配對癌旁組織中，檢測LRRC1的表達水平。使用小干擾RNA（siRNA）抑制HepG2及Huh7中LRRC1的表達后，檢測細胞增殖能力及YAP、細胞周期蛋白D1（Cyclin D1）和細胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）表達水平。通過共聚焦顯微鏡，定位HepG2細胞中LRRC1與DLG1分布。結果 肝細胞癌患者癌灶中LRRC1表達量較癌旁組織升高。siRNA 抑制HepG2及Huh7細胞中LRRC1基因表達后，細胞增殖能力受到抑制，YAP、Cyclin D1及CDK4表達水平下降。鏡下發現HepG2細胞中LRRC1與DLG1均主要分布于細胞膜內側面，兩者分布位置高度重疊。結論 LRRC1通過DLG1/YAP信號通路調控細胞周期，促進肝癌細胞增殖。

【關鍵詞】肝細胞癌;富含亮氨酸的重復序列蛋白1;巨盤狀蛋白1;細胞周期;增殖

LRRC1 promotes proliferation of hepatocellular carcinoma cells via DLG1/YAP signaling pathway Xi Xiaoli， Zhou Haoxiong， Yang Bilan， Wu Bin， Yang Yidong. Department of Gastroenterology， the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510630， China

Corresponding author， Yang Yidong， E-mail： yangyd6@ mail. sysu. edu. cn

【Abstract】Objective To investigate the mechanism of leucine-rich repeat-containing protein 1 （LRRC1） in regulating the proliferation of hepatocellular carcinoma （HCC） cells through the discs large MAGUK scaffold protein 1/Yes associated transcriptional regulator （DLG1/YAP） signaling pathway. Methods The expression levels of LRRC1 protein in the cancer tissues and paired adjacent tissues of HCC patients were detected by Western blot and immunohistochemistry. After down-regulating the expression levels of LRRC1 protein by using small interfering RNA （siRNA） in liver cancer cell lines HepG2 and Huh7， cell proliferation ability was detected by cell counting kit-8 （CCK-8 kit） for three times. The expression levels of YAP protein， Cyclin D1 and cyclin dependent kinase 4 （CDK4） were detected by Western blot. Finally， the distribution of LRRC1 and DLG1 proteins expressed in HepG2 cells was located by immunofluorescence under confocal microscope. Results The expression level of LRRC1 protein in the cancer tissues of HCC patients was significantly higher than that in the paired adjacent tissues. After down-regulating the expression levels of LRRC1 protein in both HepG2 and Huh7 cell lines by siRNA， the cell proliferation ability was significantly inhibited， and the expression levels of YAP protein， Cyclin D1 and CDK4 were down-regulated. Confocal microscope demonstrated that LRRC1 and DLG1 proteins were mainly distributed on the inner surface of HepG2 cell membrane. The distribution patterns of them were highly overlapped. Conclusions LRRC1 can regulate the cell cycle through the DLG1/YAP signaling pathway， thereby promoting the proliferation of HCC cells.

【Key words】Hepatocellular carcinoma;Leucine-rich repeat-containing protein 1;

Discs large MAGUK scaffold protein 1;Cell cycle;Proliferation

肝細胞癌是肝癌最主要的病理分型，具有高發病率及高病死率的特點，但是，肝細胞癌的具體分子發病機制尚不明確。既往研究顯示，肝細胞癌與其他上皮來源的惡性腫瘤類似，組織結構改變以及細胞極性丟失是導致肝細胞癌發生、發展的重要機制，而極性蛋白LAP家族具有維持組織正常結構和細胞極性的重要功能，其功能異常或者異常表達參與了多種腫瘤的發生、發展[1]。富含亮氨酸的重復序列蛋白1（LRRC1）是一種524個氨基酸的蛋白，也稱為LANO蛋白，其屬于LAP蛋白家族[2]。研究顯示，LRRC1在肝癌中具有促進癌細胞增殖的作用，但未對其具體分子機制進行進一步研究[3]。我們既往的肝癌基因芯片表達譜研究顯示，LRRC1在肝癌患者癌灶中異常高表達[4]。因此本研究旨在探索LRRC1是否影響肝癌的發生、發展及其可能存在的相關分子機制。

材料與方法

一、材料來源

肝細胞癌組織樣品共10例，收集2014年4月至12月在中山大學附屬第三醫院通過肝細胞癌手術切除的病理組織標本，配對癌旁組織在距離肝癌癌灶邊緣2 cm以上區域收集，通過HE染色對所有組織標本進行病理確認。依據中山大學附屬第三醫院臨床醫學研究倫理委員會制定的臨床倫理學標準進行樣本收集，亦獲得倫理委員會的批準（中大附三醫倫[2014]2-7號），標本收集前已獲取患者的知情同意及簽署知情同意書。

二、實驗試劑及儀器

1.主要試劑及抗體

LRRC1抗體（GeneTex， 美國），巨盤狀蛋白1（DLG1）抗體（Santa Cruz， 美國），Yes相關蛋白（YAP）、細胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、細胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）抗體（CellSignaling Technology， 美國），β-actin抗體（Sigma-Aldrich， 美國），LRRC1 小干擾RNA（siRNA）（上海吉瑪制藥技術有限公司），DAPI試劑（Invitrogen， 美國），DAB顯色液（DAKO， 丹麥;CCK-8試劑盒（Dojindo， 日本）;Lipofectamin 2000（Invitrogen， 美國）。DMEM培養液（Gibco， 美國）、胎牛血清（Gibco， 美國）、肝癌細胞系HepG2及Huh7由中山大學附屬第三醫院中心實驗室惠贈。

2.主要儀器

NanoDrop2000微量紫外分光光度計（Thermo-Scientific，美國），PCR儀（Labnet，美國），SDS-PAGE電泳槽（BIO-RAD， 美國），轉膜儀（BIO-RAD， 美國），顯微鏡成像系統（Leica， 德國），激光共聚焦顯微鏡（Leica， 德國）等。

三、實驗方法

1.免疫組織化學染色及免疫細胞熒光染色后激光共聚焦顯微鏡觀察

肝癌病理標本切小塊，甲醛固定后，經過70%、95%、100%不同濃度乙醇階梯脫水，二甲苯組織透明后，浸蠟包埋，切片制成石蠟切片。石蠟切片后經二甲苯脫蠟和100%、95%、70%不同濃度乙醇梯度水化后，放置于3%H2O2中10 min消除切片組織中的過氧化物酶，在Tris-EDTA抗原修復液（pH 9.0）中高壓抗原修復2 min，加入稀釋后的抗LRRC1（1∶100）一抗4℃孵育過夜;磷酸鹽吐溫緩沖液（PBST）浸泡5 min后，二抗37℃孵育2h，PBST浸泡15 min，滴加DAB進行顯色反應，適時以適量超純水清洗終止顯色反應，蘇木素染核后，進行樹脂封片，并于顯微鏡下觀察。HepG2種于35 mm玻底皿，使用細胞培養液（DMEM和10%胎牛血清）培養，細胞密度達40%后，使用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3次，使用4%多聚甲醛室溫固定20 min，加入0.5%曲拉通;加入稀釋后的一抗：抗LRRC1（1∶100）及抗DLG1（1∶100）4℃孵育過夜，PBS洗滌3次后加入488 nm及594 nm波長的二抗，避光條件下37℃孵育2 h，PBS洗滌3次，DAPI染核后，PBS洗滌3次，使用激光共聚焦顯微鏡觀察。

2.細胞培養及處理

將HepG2及Huh7細胞分別接種于6孔板中，使用細胞培養液培養，待細胞密度達60%后，細胞分別予空白對照siRNA（siNC組）及LRRC1基因沉默siRNA（siLRRC1組）處理細胞，每組3個重復孔，轉染操作流程按照Lipofectamin 2000試劑盒說明書，轉染后48 h收取細胞進行下一步研究。

3.細胞總蛋白、組織蛋白提取以及蛋白電泳

細胞處理后，在6孔板中加入細胞裂解液（細胞裂解液中提前按照1∶100加入蛋白酶抑制劑PMSF），細胞刷輕輕刮下細胞，混勻后冰上裂解30 min，通過BCA法計算裂解液中蛋白濃度，100℃加熱5 min變性后，直接電泳或分裝后放置于-80℃保存。蛋白電泳操作步驟參考文獻[5]，按每孔相同的蛋白濃度取適量蛋白標本進行蛋白電泳并轉移至硝酸纖維膜后，5%脫脂牛奶封閉2 h，根據目標蛋白的分子量分別將不同條帶浸泡至稀釋后的一抗稀釋液中：抗LRRC1（1∶1000）、抗DLG1（1∶500）、抗YAP（1∶1000）、抗Cyclin D1（1∶1000）、抗CDK4（1∶1000）、抗β-actin（1∶5000），4℃孵育一抗搖床過夜后，Tris-鹽酸鹽吐溫緩沖液（TBST）洗滌2次，每次10 min，常溫孵育二抗2 h后，TBST洗滌3次，每次10 min，暗房中ECL發光液發光后壓片曝光顯像。

4. 細胞活性測定

HepG2及Huh7經siRNA處理后，將細胞從6孔板消化脫落后接種于96孔板，每孔接種細胞數量為1000個，每孔內加入200 μl 細胞培養液，每組設3個重復孔，接種24 h細胞貼壁后，將每孔全部培養液吸出，每個檢測孔中加入100 μl檢測培養液（含10 μl的CCK-8檢測溶液和90 μl的DMEM培養液）。繼續在細胞培養箱避光孵育2 h，使用酶標儀測定波長490 nm下每孔的吸光度，記為該檢測孔的細胞增殖活性，重復上述實驗共3次。

四、統計學處理

運用SPSS 20.0進行統計學分析。正態分布資料以表示，應用獨立樣本t檢驗對2組獨立樣本進行比較，應用配對t檢驗對配對樣本進行比較，P < 0.05為差異有統計學意義。

結果

一、人肝癌癌灶組織和配對癌旁組織中LRRC1蛋白表達分析

對人肝癌癌灶組織和配對癌旁組織進行免疫組織化學染色，結果顯示在癌灶組織中，LRRC1蛋白陽性信號明顯多于其配對的癌旁組織（圖1A）。通過對10例肝癌組織樣品進行免疫組織化學染色后隨機挑選視野計數900個細胞LRRC1蛋白陽性表達情況，統計發現，LRRC1在肝癌癌灶組織[（71.3±8.9）%]中的表達高于配對的癌旁組織[（21.2±11.9）%]，t=20.37，P < 0.001。收集肝癌患者的臨床資料，分析肝癌癌灶中LRRC1表達與患者年齡、性別、HBV感染、腫瘤大小、TNM分期及肝硬化的相關性，結果顯示LRRC1表達與上述臨床指標無相關性，組間差異均無統計學意義（P均> 0.05），見表1。對人肝癌癌灶組織和配對癌旁組織進行蛋白免疫印跡檢測，結果顯示LRRC1在肝癌癌灶組織與配對癌旁組織中的表達差異與免疫組織化學染色結果相一致（圖1B）。

二、抑制LRRC1蛋白表達后肝癌細胞活性分析

使用siRNA抑制肝癌細胞HepG2及Huh7中LRRC1蛋白的表達后，利用CCK-8檢測試劑盒進行細胞活性檢測，結果顯示HepG2及Huh7細胞中LRRC1蛋白表達抑制后，細胞活性下降（圖2），見表2、3。

三、抑制LRRC1蛋白表達后肝癌細胞周期相關蛋白表達情況

通過siRNA抑制HepG2及Huh7細胞中的LRRC1蛋白的表達后，通過蛋白免疫印跡法檢測各分組中DLG1、YAP及周期相關蛋白Cyclin D1、CDK4蛋白表達量。實驗結果顯示，siRNA下調細胞中的LRRC1蛋白的表達后，細胞中DLG1蛋白水平并無明顯改變，YAP及周期相關蛋白Cyclin D1、CDK4蛋白表達量均下降（圖3A）。

四、HepG2細胞內LRRC1與DLG1分布研究

使用共聚焦顯微鏡對HepG2細胞中LRRC1及DLG1蛋白的分布進行分析，結果顯示，LRRC1及DLG1蛋白均主要分布于細胞膜內側面，小部分游離分布于胞漿中，兩者的分布位置高度重疊（圖3B）。

討論

肝細胞癌是高發病率與高死亡率的惡性腫瘤，其具體發病機制有待進一步研究探索。本實驗中，我們在肝癌患者病理組織及肝癌細胞系中進行研究，結果顯示極性蛋白LRRC1在肝癌癌灶組織中異常高表達，在肝癌細胞中下調LRRC1，可抑制肝癌細胞增殖，進一步的分子機制研究顯示，LRRC1可能通過與DLG1相互作用，上調YAP蛋白水平，從而通過調控細胞周期促進肝癌細胞的增殖。

上皮細胞形態具有極性，可分為頂端和基底端，表現為形態的不對稱，這種具有極性的形態作為上皮細胞的特點，極性蛋白通過調控細胞間黏附及信號通路級聯傳導，維持著細胞極性、形態，保持細胞間的緊密連接以及組織的正常三維結構，共同發揮維持上皮組織的形態結構的重要作用[6-7]。肝細胞癌作為上皮來源的惡性腫瘤之一，肝細胞極性丟失伴隨增殖異常是導致肝細胞癌發生、發展的重要機制，但肝癌細胞極性蛋白的具體作用機制仍未明了。多項研究提示，極性蛋白LRRC1在肝細胞癌、非小細胞肺癌等多種惡性腫瘤中均異常高表達[8-9]。有研究者認為，LRRC1在肝癌中高表達與細胞中LRRC1基因啟動子區域去甲基化相關[9]。我們的前期基因芯片表達譜研究同樣發現，極性蛋白LRRC1在肝癌癌灶中異常高表達（GEO： GSE67764）[4]。在本研究中，我們通過免疫組織化學染色及蛋白免疫印跡法檢測證實了肝癌中LRRC1蛋白表達上調，提示LRRC1表達上調在肝癌中可能發揮重要作用。在往后的進一步的實驗中，肝癌中LRRC1異常高表達的分子機制有待進一步探索。研究顯示LRRC1的表達與肝癌患者的預后呈負相關關系，LRRC1可作為肝癌預后評估的標志物之一[3]。在本研究中，我們分析了肝癌癌灶中LRRC1表達與患者年齡、性別、HBV感染、腫瘤大小、TNM分期及肝硬化等臨床特征間的相關性，結果顯示LRRC1表達與上述臨床特征無相關性，考慮到本研究納入的臨床標本較少，今后我們將進一步增加研究樣本量，針對LRRC1的臨床意義及作為肝癌預后標志物之一的臨床價值進行深入挖掘證實。

通過細胞活性實驗，我們證實了LRRC1具有促進肝癌細胞增殖的作用，此結果與既往研究結果相符[3]。極性蛋白LRRC1缺乏PDZ結構域，是其區別于LAP家族其他蛋白成員的重要特點，雖然缺乏PDZ結構域，LRRC1可以通過其C端的TSV序列，與具有PDZ結構域的蛋白，如DLG1等相互作用，調控下游信號傳導[10]。既往肝癌細胞及肝癌患者組織標本研究已證實DLG1蛋白的表達水平與YAP的活性呈負相關，DLG1蛋白具有抑制YAP活性的功能[11]。Hippo/YAP信號通路在生物生長、發育過程中具有調控細胞生長速度，限制器官體積等作用，YAP蛋白作為Hippo信號通路中的核心效應蛋白，在其上游的LATS1/2作用下導致YAP磷酸化，磷酸化的YAP將滯留于胞漿中泛素化并降解，使YAP下游通路處于靜止狀態;當受到氧化應激、缺血缺氧、物理因素、G蛋白耦聯受體等途徑刺激后，可減少YAP降解，增多的YAP與TAZ結合并進入細胞核與轉錄因子TEADs共同發揮信號轉錄功能，促進靶基因的表達[12]。Hippo/YAP信號通路的調控異常，可促進細胞異常增殖并拮抗凋亡，導致腫瘤的發生、發展，因此LRRC1通過DLG1調控YAP可能是LRRC1促進肝癌細胞增殖的機制[13]。在進一步的分子機制研究中，我們發現LRRC1蛋白水平與YAP蛋白的表達水平呈正相關;同時，LRRC1的表達水平與周期相關蛋白Cyclin D1及CDK4表達水平也呈正相關關系。通過激光共聚焦顯微鏡對LRRC1及DLG1蛋白進行細胞內定位，提示兩者在細胞內可能存在相互作用。LRRC1及DLG1的相互作用目前未完全明了，部分研究顯示正常狀態下極性蛋白之間的相互協同作用可增強極性蛋白維持細胞形態及正常的信號傳導功能。另有研究顯示，在疾病狀態下，如腫瘤細胞內，異常增多的極性蛋白之間產生拮抗作用，導致極性蛋白的功能受到抑制[14-16]。本實驗的研究結果提示，肝癌細胞內異常增多的LRRC1與DLG1結合后，可能抑制DLG1發揮其正常功能，導致YAP及下游通路的異常活化。在今后進一步的實驗中，需要完善免疫共沉淀實驗、GST蛋白沉降實驗等方法證實LRRC1與DLG1的相互作用，并深入研究對下游YAP蛋白及細胞周期的影響及分子機制。

綜上所述，LRRC1在肝癌細胞中異常高表達，可能通過與DLG1相互作用，上調YAP蛋白水平，從而通過調控細胞周期而促進肝癌細胞的增殖。本研究對LRRC1在肝癌的發生、發展的作用及可能機制提供了科學依據。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2020-12-18）

（本文編輯：楊江瑜）