自身免疫性肝炎患者外周血中Linc00324的表達及臨床意義

楊亞俊 史 英 杜成鋒

1.陜西中醫藥大學第二附屬醫院檢驗科 (陜西 咸陽， 712000) 2.陜西中醫藥大學第二附屬醫院消化科 3.陜西榆林市星元醫院檢驗科

自身免疫性肝炎是以免疫介導的肝臟病理損傷和肝功能異常為主要表現的慢性肝病，發病機制尚未完全明確，與遺傳易感性、免疫調節異常及環境因素有關[1-4]。臨床上主要通過臨床表現、血液生化指標檢測，必要時輔以病理檢測進行確診，但檢測耗時繁瑣，影響患者及時判斷病情，因此尋求自身免疫性肝炎特異性指標有助于臨床確診。lincRNA在固有免疫及獲得性免疫中發揮重要作用[5]，Linc00324是近年來研究較為廣泛的lincRNA。本研究前期發現Linc00324在自身免疫性肝炎患者外周血白細胞中表達較高，尤其在CD4細胞中明顯上調，猜測Linc00324可能參與自身免疫性肝炎的免疫調控。因此本研究重點探討Linc00324在自身免疫性肝炎患者中的表達異常，為臨床確診提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年9月至2019年6月本院消化內科經臨床確診的自身免疫性肝炎患者55例為自身免疫性肝炎組，男26例，女29例；年齡30～60歲，平均(43.15±5.26)歲。患者均符合自身免疫性肺炎診斷標準[6]，均未接受治療，排除遺傳性疾病者、合并感染性疾病者、藥物性肝損傷、酒精性肝損傷、合并惡性腫瘤及其他自身免疫性肝病者。另取同時期體檢健康者61例為正常組，男28例，女33例；年齡30～60歲，平均(43.24±5.10)歲，既往無自身免疫性疾病病史。

1.2 實驗方法

1.2.1 標本收集 抽取所有受試者空腹靜脈血5 ml，分成兩管，其中一管-80℃保存；另一管3 000 r/min，-4℃冷凍離心10 min，分離得上清液，-80℃保存。

1.2.2 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)法檢測血清Linc00324表達水平 按照Trizol試劑盒操作說明提取血清標本中總RNA，并通過反轉錄酶試劑盒Superscript Ⅲ將RNA反轉錄合成cDNA。采用Real Master Mix試劑盒并利用SYBR Green Ⅰ染料進行實時熒光定量PCR檢測Linc00324表達水平，PCR反應條件：95℃ 10 min、(95℃ 15 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s)×40個循環。采用2-ΔΔCt算法計算Linc00324相對表達量。以GAPDH為內參基因，其引物序列：正向5′-GGGAAUAGUAGCUGUCAAATT-3′，反向5′-UUUGACAGCUACUAUUCCCTT-3′；Linc00324引物序列：正向5′-ACTCTACCTACATCTGGGACACT-3′，反向5′-GTAGGTCCCATGGTCATCCAG-3′。試驗重復3次，取平均值。

1.2.3 生化、免疫指標檢測 收集患者入院時肝功能檢測指標，包括谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、總膽紅素(TBil)、堿性磷酸酶(ALP)，谷氨酰轉肽酶(GGT)。免疫指標包括抗核抗體(ANA)、抗平滑肌抗體(SMA)、抗線粒體抗體(AMA)、免疫球蛋白G(IgG)，由檢驗科生化、免疫室檢測。

1.2.4 免疫細胞測定 取外周血標本，EDTA抗凝后加PE標記的鼠抗人CD4+抗體，FITC標記的鼠抗人CD8+抗體各20 μl，渦旋振蕩器混勻，于室溫下避光反應15 min，加入溶血素1 ml，室溫避光20 min，加入PBS緩沖液2 ml，離心，棄上清，加入1%多聚甲醛500 μl重懸細胞，上機檢測CD4+、CD8+T細胞的比率。上機前常規對流式細胞儀進行檢測，控制儀器各項指標在質控允許值內。上機檢測時首先按照前向散射(FSC)和側向角散射(SSC)光信號予淋巴細胞群設門，每份檢測標本獲取設門內10 000個細胞，檢測后所得數據以Listmode文件保存。以CD4+/CD8+細胞比例作為Th/Ts細胞比例。

2 結果

2.1 兩組受試者血清Linc00324表達及IgG水平情況 見表1。

表1 兩組受試者血清Linc00324表達及IgG水平情況

2.2 兩組受試者自身抗體陽性率比較 自身免疫性肝炎組ANA陽性率為89.09%(49/55)，SMA陽性率為18.18%(10/55)，AMA陽性率為0。正常組均未發現ANA、SMA、AMA陽性。ANA陽性(>1∶40)，SMA陽性(>1∶40)，AMA陽性(>1∶100)。

2.3 自身免疫性肝炎患者及正常者肝功能指標比較 與正常組相比，自身免疫性肝炎患者血清ALT、AST、TBil、ALP、GGT水平均顯著升高(P<0.05)，見表2。

2.4 兩組受試者免疫細胞水平比較 與正常組相比，自身免疫性肝炎組患者Th細胞比例、Th/Ts比值顯著升高(P<0.05)，Ts細胞比例顯著降低(P<0.05)，見表3。

2.5 自身免疫性肝炎患者血清Linc00324水平與各指標相關性 自身免疫性肝炎患者血清Linc00324水平與ALT、AST、ALP、IgG、Th、Th/Ts正相關(P<0.05)，與Ts負相關(P<0.05)，與TBil、GGT無相關性(P>0.05)，見表4。

表2 兩組受試者肝功能指標比較

表3 兩組受試者免疫細胞水平比較

表4 自身免疫性肝炎患者血清Linc00324水平與各指標相關性

2.6 血清Linc00324水平對自身免疫性肝炎的診斷作用 ROC曲線顯示，血清Linc00324水平診斷自身免疫性肝炎的曲線下面積為0.795，截斷值為2.031，敏感度為78.2 %，特異度為81.3 %，見圖1。

圖1 血清Linc00324水平對自身免疫性肝炎的診斷ROC曲線

3 討論

自身免疫性肝炎是自身免疫性肝病中最常見的類型，其性別、年齡分布與紅斑狼瘡類似，其發病與自身免疫功能失調密切相關[7]。隨著醫學進展，人們對自身免疫性肝炎研究更加深入。研究顯示，自身免疫性肝炎患者血清內出現大量自身抗體，提示自身抗體的升高促進自身免疫性肝炎的發生[8]。探索加速自身免疫性肝炎發展的因素，可為判斷自身免疫性肝炎的發生及延緩疾病進程提供理論依據。

LincRNA本身不可被翻譯為蛋白質，結構與mRNA類似，在染色體沉默、染色質修飾、轉錄激活等多種生物學過程中存在調控作用，LincRNA對獲得性免疫和固有免疫均有一定影響[9]。Yang等[10]研究顯示，lincRNA MALAT-1在系統性紅斑狼瘡患者血清中高表達。Linc00324位于人17p13.1[11]。本研究中自身免疫性肝炎患者外周血血清Linc00324表達顯著高于正常者，提示Linc00324可能參與自身免疫性肝炎的發病過程。

當某些特異性的抗原物質(病毒、細菌等)與人體組織具有類似的抗原結構時，天然免疫耐受狀態被打破，發生針對自身肝組織抗原的免疫應答及異常反應，造成自身肝組織損傷和炎癥，引發自身免疫性肝炎[12]。研究顯示，免疫調節失衡是引起自身免疫性肝炎的原因之一，當Ts細胞功能過低或Th細胞過度時，會導致自身抗體的產生[13]。Stashenko等[14]研究顯示，Sprague-Dawley大鼠中隨著鼠齡的增長Ts細胞明顯減少，而Ts細胞功能的過早降低，可導致過量自身抗體出現，誘發與人類系統性紅斑狼瘡類似的自身免疫性疾病。本研究中，自身免疫性肝炎患者較健康者Th/Ts細胞比例上升，提示Th/Ts比例失衡可能參與自身免疫性肝炎病變過程。

自身免疫性肝炎患者肝功能嚴重受損，以血清AST、ALT水平升高為主要特征[15]。本研究中自身免疫性肝炎患者肝功能指標血清AST、ALT、TBil、ALP、GGT水平顯著高于正常人，提示患者肝功能受損嚴重。自身抗體表現異常在自身免疫性肝炎中較為常見。Wang等[16]研究顯示，幾乎所有自身免疫性肝炎患者均有一種或多種自身抗體明顯升高，多數患者為ANA或SMA陽性，偶爾可見抗線粒體抗體陽性。本研究55例自身免疫性肝炎患者中ANA陽性49例(89.09%)，SMA陽性10例(18.18%)，提示自身免疫性肝炎患者最常見的自身抗體為ANA和SMA，未見AMA陽性，可能是研究樣本量較少。AMA和SMA均非自身免疫性肝炎的特異性指標，在原發性膽汁性膽管炎、脂肪肝及其他自身免疫性疾病中也存在AMA和SMA抗體陽性，臨床診斷需結合其他檢查。此外Pearson分析顯示自身免疫性肝炎患者血清Linc00324水平與AST、ALT、ALP、IgG及Th/Ts均存在相關性，提示血清Linc00324水平與疾病活動密切相關，猜測Linc00324可能通過影響免疫系統平衡參與自身免疫性肝炎發生，具體機制有待進一步研究。進一步ROC分析顯示血清Linc00324水平對診斷自身免疫性肝炎的曲線下面積為0.795，特異度與敏感度分別為81.3%,78.2%，提示血清Linc00324可能能作為診斷自身免疫性肝炎的生物學指標，截斷值為2.031，表明Linc00324水平高于2.031者發生自身免疫性肝炎的風險高，為臨床及科研人員對自身免疫性肝炎研究及治療提供了靶點。

綜上所述，自身免疫性肝炎患者血清Linc00324高表達，與臨床肝功能指標、免疫細胞水平密切相關，可能成為自身免疫性肝炎的診斷標志物。但本研究也存在一定不足，選取樣本量較少，需進一步擴大樣本。