miR-21和TIPE1在肝癌組織中的表達及其臨床意義*

鄭少華 夏菁菁 賈真麗 侯麗麗 程 雪 李恒力 趙 彩

1.河北省衡水市人民醫院肝膽胰外科 (河北 衡水， 053000) 2.衡水市人民醫院消化內科

肝細胞癌(HCC)仍然是癌癥相關死亡的第三大常見原因，中國是肝癌發病最嚴重的國家之一，大約80%的肝癌病例與乙型肝炎病毒(HBV)感染和黃曲霉毒素接觸有關[1]。除晚期肝癌外，肝移植和手術切除是治療肝癌的最佳選擇[2]。然而，肝癌根治性切除術后長期預后仍然令人失望，因為腫瘤復發率高，據報道5年后有70%的病例復發。監測計劃、個體化治療和隨訪可能會改善肝癌患者的預后[3]。miR-21是一種關鍵的癌基因microRNA(miR)，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)誘導蛋白8樣-1(TNFAIP8L1或TIPE1)是TIPE家族的新成員，本文探討了HCC患者肝癌組織及外周血中miR-21和TIPE1的表達水平以及臨床意義，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院收治的229例HCC患者，所有患者均經病理檢查確證，術前均未接受化療或放療，術中采集肝癌及癌旁組織標本，癌旁組織定義為距腫瘤邊緣至少1 cm的組織。患者一般情況及臨床病理特征見表1。本研究經我院倫理委員會審批同意，所有受試者均簽署書面知情同意。

表1 患者一般情況及臨床病理特征 (n=229)

1.2 研究方法

1.2.1 生存率研究 肝切除術后每3個月隨訪1次。常規檢查包括腫瘤標志物、肝功能和腹部B超，每6個月或血清AFP持續升高時進行腹部CT和/或MRI檢查，根據2項或2項以上的影像學檢查發現新病灶即診斷為復發。總生存率(OS)的研究終點為手術切除后至死亡或最近的隨訪時間，無復發生存率(RFS)的研究終點為手術切除后至首次診斷復發的時間。

1.2.2 miR-21表達水平檢測 采用ABI-PRISM 7900HT RT-PCR系統，進行實時定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測患者肝癌組織及外周血中miR-21表達水平。利用TRIzol試劑(Invitrogen公司)提取細胞總RNA，逆轉錄試劑盒(Takara公司)轉錄為cDNA，qRT-PCR試劑盒(TaKaRa公司)檢測miR-21轉錄水平。程序設置如下： 95℃ 1 min，95℃ 15 s，60℃ 15 s，72℃ 30 s，35個循環；95℃、65℃、30℃各1 min。采用2-ΔΔCt法計算目的基因表達水平。

1.2.3 Western Blot分析 收集肝癌組織，在冰冷裂解緩沖液中裂解。BCA蛋白質測定試劑盒測量蛋白質濃度，10% SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白質，然后電轉移到PVDF膜(美國Millipore公司)上孵育anti-TIPE1和anti-GAPDH抗體，再與HRP結合的抗兔IgG抗體(1∶5 000稀釋，CST公司)孵育1 h，然后進行增強化學發光(美國Santa Cruz公司)和顯影，采集圖像并分析目的蛋白表達水平。

1.3 統計學方法 數據分析采用GraphPad Prism 7.0軟件，組間比較采用t檢驗。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 HCC患者外周血及肝癌組織miR-21表達情況 與正常人群或癌旁組織比較，HCC患者外周血和肝癌組織miR-21表達量顯著提高(圖1A，1C)；Ⅲ～Ⅳ期HCC患者外周血和肝癌組織miR-21表達顯著高于Ⅰ～Ⅱ期患者(圖1B、1D)。

2.2 miR-21對HCC患者OS和RFS的影響 miR-21低表達組HCC患者的OS和RFS優于miR-21高表達組，見圖2。

2.3 HCC患者外周血及肝癌組織TIPE1表達情況 與正常人群或癌旁組織比較，HCC患者外周血和肝癌組織TIPE1 mRNA表達量顯著提高(圖3A、3C)；Ⅲ～Ⅳ期HCC患者外周血和肝癌組織TIPE1 mRNA和蛋白表達均顯著高于Ⅰ～Ⅱ期患者(圖3B、3D、3E、3F)。

2.4 TIPE1對HCC患者OS和RFS的影響 TIPE1低表達組HCC患者的OS和RFS優于TIPE1高表達組，見圖4。

圖1 HCC患者外周血及肝癌組織miR-21表達情況 A、B為HCC患者外周血，C、D為HCC患者肝癌組織

圖2 miR-21對HCC患者OS和RFS的影響

圖3 HCC患者外周血及肝癌組織TIPE1表達情況 (A、B為肝癌患者血清mRNA表達量，C、D為肝癌組織mRNA表達量，E、F為肝癌組織蛋白表達量)

圖4 TIPE1對HCC患者OS和RFS的影響

3 討論

MicroRNAs(miRs)是一類參與細胞增殖、分化、凋亡和發育等生物學過程的小分子非編碼RNA，由于癌基因miRs(oncomiRs)的基因擴增、異常表達和功能突變增加，以及腫瘤抑制miRs(suppressor miRs)的缺失或失活，miRs在人類癌癥中的調節失調。基于miR的治療策略有望用于癌癥治療[4]。然而，單靶向miR不足以在體內獲得顯著的治療效果。miR-21是一種關鍵的癌基因，在多種癌癥類型中高度表達，研究表明miR-21過度表達通過抑制一系列腫瘤抑制基因的表達促進增殖、侵襲和遷移[5]，有研究發現GAS5可以通過抑制肝癌細胞miR21的表達來抑制肝癌細胞的轉移[6]。研究表明，miR-21與結直腸癌、食管癌和肝細胞癌的預后有關[7]，miR-21通過TGF-β變異或PPP2R2A/ERK參與膀胱癌的發展和進展[8]。miR-21的下調通過靶向PI3K/AKT和JAK/STAT3信號通路誘導細胞凋亡，并可能與其他miR和微調蛋白輸出協同或協同作用[9]。本研究發現，在HCC患者外周血和肝癌組織中miR-21表達量顯著提高，Ⅲ～Ⅳ期HCC患者外周血和肝癌組織的miR-21表達顯著高于Ⅰ～Ⅱ期HCC患者，miR-21低表達組患者的OS和RFS優于miR-21高表達組，說明miR-21在肝癌的發生、發展以及預后中具有及其重要的作用。

TIPE1是TIPE家族的新成員，TIPE家族的成員被認為是免疫穩態、炎癥和腫瘤發生的調節者，盡管它們具有顯著的結構域同源性，但它們的生物學功能是多項的[10]。與TIPE2不同，TIPE1除了在成熟的B和T淋巴細胞和大多數人類癌細胞系中表達外，在各種小鼠組織中都有表達[11]。TIPE1在某些炎癥性疾病中起負調節作用，可通過下調MDR1的轉錄使骨肉瘤細胞對順鉑敏感減弱[11]。有研究報道TIPE1可通過負調控Rac1的激活而誘導肝癌細胞凋亡，抑制骨肉瘤、肺癌和胃癌中的腫瘤生長、侵襲和遷移[12]。TIPE1在體內和體外都能顯著降低乳腺癌細胞的生長。在致癌方面的作用，TIPE1通過抑制Rac1及其靶點p65和c-Jun的 N-末端激酶途徑顯著減少，誘導HCC細胞增殖并誘導caspase非依賴性凋亡；也有報道TIPE1通過抑制p53活性促進宮頸癌增殖[13]。我們發現，在HCC患者外周血和肝癌組織中TIPE1 mRNA表達量顯著提高，Ⅲ～Ⅳ期HCC患者的外周血和肝癌組織的TIPE1 mRNA、蛋白表達均顯著高于Ⅰ～Ⅱ期HCC患者。TIPE1低表達組HCC患者的OS和RFS優于TIPE1高表達組，說明TIPE1 在肝癌中發揮重要的調控作用，并參與了疾病的進程。

本研究發現miR-21和TIPE1在HCC患者外周血和肝癌組織中明顯升高，與腫瘤的分化程度關系密切，與HCC患者生存率具有相關性，提示 miR-21和TIPE1可能作為HCC潛在預后評價指標。本次研究主要是臨床樣本的回顧性分析與總結，對miR-21和TIPE1如何參與調控HCC的機制尚不清楚，在今后的研究工作中需要深入探討miR-21和TIPE1參與調控HCC肝癌發生發展的具體分子作用機制，為肝癌分子診斷與靶向治療提供堅實的理論和實驗基礎。