兩種HBV DNA熒光定量PCR檢測試劑的檢測能力精度比較

巫智勇 葉 英

安徽省合肥市安徽醫科大學第一附屬醫院 (安徽 合肥， 230032)

乙型肝炎病毒(HBV)感染是我國極為重要的公共衛生問題。HBV DNA的復制是乙肝病情進展的主要原因，采用PCR方法定量檢測HBV DNA對慢性乙型肝炎的診斷、治療和預后判斷具有重要意義[1]。Cobas系統是Roche公司研制的用于核酸檢測的實時熒光定量PCR方法，其檢測的下限可達到20 IU/ml，上限為1.7×108IU/ml，定量線性范圍較廣。2007年美國即推薦使用Cobas試劑作為HBV DNA檢測的方法，然而這種國際公認的HBV DNA精準定量的檢測方法，由于其試劑價格昂貴，且必須采用Roche公司專用PCR儀，故在我國難以廣泛使用。目前國內大多采用國產試劑檢測HBV DNA，國產試劑的檢測下限一般均為1 000 copy/ml。在臨床實踐中發現，病毒低水平復制與疾病進展關系密切。慢乙肝患者經過長期抗病毒治療，血清中HBV沒有<20 IU/ml時，會導致肝臟疾病繼續進展，甚至發生HCC[2]。Choi等[3]研究進一步證明了核苷類藥物治療必須將血清DNA降得越低越好。本研究對未經和已經進行核苷類藥物抗病毒治療的乙型肝炎患者，進行了Cobas和國產試劑的同步檢測，以了解兩者檢測精度的差異，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 血清標本 先后收集安徽醫科大學一附院2019年3月至2019年6月期間門診和住院的未經和已經進行核苷類藥物治療的慢性乙型肝炎或乙型肝炎肝硬化患者血清70份，所有患者均符合中華醫學會肝病學分會、感染病學分會制定的2019版《慢性乙型肝炎防治指南》的診斷標準[4]。標本均系空腹采取，2小時內分離血清并置于-20℃低溫冰箱保存。

1.2 HBV DNA定量檢測 HBV DNA分別用Cobas定量試劑(Roche)和上海之江生物科技股份有限公司試劑(ZJ)進行檢測。所有試劑均有正式批文，批檢合格并在有效期內使用，擴增反應分別在Cobas TaqMan 48 PCR儀和美國Applied Biosystem公司生產的ABI 7500基因擴增儀進行。同一份標本采用2種試劑進行平行檢測，具體操作和結果判定參照試劑盒說明進行。Roche結果電腦自動設置的單位為IU/ml，ZJ試劑單位為copy/ml，為便于比較，根據Roche的換算值：1 IU/ml=5.83 copy/ml，將單位為IU/ml的結果換算為copy/ml為單位，如20 IU/ml=116 copy/ml。

1.3 統計學方法 采用SPSS 11.5統計軟件。數據分析采用t檢驗、相關分析和χ2檢驗。檢驗水準為0.05。

2 結果

2.1 采用Roche試劑對70份標本的檢測結果 70份標本進行Roche HBV DNA檢測，其中處于Roche檢測下限(≤116 copy/ml)的標本有17份，大于Roche檢測上限(≥9.91×108copy/ml)的標本有6份，余下的47份均檢測出具體的HBV載量，病毒載量在102～103，103～104，104～105，105～106，107～108，108～大于9.91×108(copy/ml)范圍內的標本數分別為：10，9，6，9，5，6，2份。

2.2 采用國產ZJ試劑對70份標本的檢測結果 處于檢測下限(≤1 000 copy/ml)的有43份，余下的27份均檢測出具體的HBV載量，其中病毒載量在103～104，104～105，105～106，107～108，108～109，109以上(copy/ml)范圍內的標本數分別為：3，5，3，6，6，3，1份。

2.3 ZJ檢測結果與Roche檢測結果的相關性分析 由于處于ZJ檢測下限的標本有43份，處于Roche檢測下限的標本有17份，大于Roche檢測上限的標本有6份，這些結果沒有具體的數值，不適合做相關性分析，因此只對其中20份兩種檢測方法均有具體數值的進行相關性分析。ZJ試劑檢測結果與Roche檢測結果的總體相關系數r=0.612，P=0.004，說明兩者之間存在顯著的線性相關(見圖1表示的散點圖)。將標本按照病毒載量分級，在病毒載量分別為103～104，104～105，105～106，106～107，107～108，108～109(copy/ml)范圍內的標本中，國產ZJ試劑檢測結果與Roche定量結果的相關性分別為：-0.081，0.311，-0.081，0.311，0.271，0.387，檢測P值分別為：0.504，0.009，0.504，0.009，0.023，0.001。再按照以下5個范圍內的病毒載量分級：103～104，103～105，103～106，103～107，103～108(copy/ml)，國產ZJ試劑檢測結果與Roche定量結果的相關性分別為：-0.129，0.107，0.13，0.304，0.295，檢測P值分別為：0.287，0.378，0.283，0.011，0.013，可見在103107copy/ml范圍以上，兩種檢驗方法間存在顯著的線性相關。

圖1 Roche試劑檢測結果與ZJ試劑檢測結果的相關性分析(r=0.612，P=0.004)

2.4 ZJ試劑檢測結果低于檢測下限的與Roche檢測結果的比較 采用ZJ試劑檢測結果陰性(低于檢測下限)的標本有43份，應用Roche定量檢測結果分別為：處于檢測下限(≤116 copy/ml)的標本有17份，占39.5%；處于102～103的標本有10份，占23.3%；處于103～104的標本有9份，占20.9%；處于104～105的標本有2份，占4.7%；處于105～106范圍內的標本有5份，占11.6%。共26份(60.5%)的病毒載量在106 copy/ml 范圍的標本ZJ檢測為低于檢測下限，ZJ試劑檢測結果低于檢測下限的與Roche檢測結果的比較如圖2所示。ZJ試劑檢測結果≤1 000 copy/ml而Roche檢測結果>1 000 copy/ml的，即ZJ試劑檢測結果呈假陰性的標本有16例，占37.2%。

圖2 國產HBV DNA陰性患者43例采用羅氏HBV DNA檢測分布圖

3 討論

對全部標本的檢測結果進行相關性比較，結果顯示，ZJ試劑與Roche試劑具有較好的相關性(r=0.612，P=0.004)，表明國產試劑總體來說反映了標本中的病毒載量水平，可以用于常規檢測。將檢測結果按不同HBV DNA拷貝水平進行分組分析，發現ZJ試劑僅與病毒載量在107copy/ml以上的標本具有較好的相關性，而病毒載量低于≤106copy/ml范圍內的標本相關性差，沒有統計學意義，這與薛艷等報道相似[5，6]。國產試劑對于病毒載量低于106copy/ml 的標本檢測結果的問題突出體現在三個方面：①檢測結果準確性差；②相當比例的標本國產試劑出現檢測值≤1 000 copy/ml，病毒載量越低，出現檢測值低于下限值的比例越高。本研究中國產試劑檢測結果陰性的標本有43份，而Roche檢測真正檢測不到的標本僅17份(39.5%)，余下的標本26份(60.5%)均檢測到病毒載量，波動范圍為在102～106copy/ml，其中，在病毒載量處于102～104copy/ml的標本有19份，占44.2%；③病毒載量低于106copy/ml的標本，國產試劑檢測結果的重復性差，同一標本不同批次的檢測結果可以相差1個數量級。上述缺點，使得ZJ試劑對于接受抗病毒治療后的個體由于體內病毒載量處于低水平而不能準確的監測，從而不能幫助醫生準確判斷乙肝抗病毒治療的關鍵時間點如第24周或48周的療效，以及在長期抗病毒治療中不能夠將病毒降到越低越好從而減少肝癌發生的要求。2019年慢性乙型肝炎防治指南指出，只要HBV DNA陽性，不論載量高低，合并有肝臟損傷時，就需立即抗病毒治療[4]。部分患者由于國產試劑檢測結果的精度問題，延誤了治療而出現病情進展。

本研究發現ZJ試劑檢測結果≤1 000 copy/ml而Roche檢測結果>1 000 copy/ml的標本有16份，占ZJ試劑檢測結果呈陰性的43份標本的37.2%。這種假陰性的發生可能是病毒變異或不同基因型的病毒感染造成的特異性引物或探針結合區不能有效結合，無法水解探針激發熒光有關，鑒別這種假陰性可以參考HBV血清學和肝功能檢測結果，或進行HBV DNA復測。若無Roche檢測，則通過應用國內不同廠家(主要是引物和探針不同)的試劑進行平行檢測而確定[7，8]。ZJ試劑檢測結果呈陰性而Roche檢測結果處于102～103copy/ml的有10份，占ZJ試劑檢測結果呈陰性的43份標本的23.3%，這種假陰性的發生可能與Roche檢測病毒載量在103copy/ml 以上的標本的假陰性不完全相同，這主要因Cobas TaqMan Amplicor系統有以下兩個特性：①在引物和探針設計上，選擇適合所有不同基因型HBV的檢測；②設立內部標準品(QS)的管內質控，一方面用于定量，另一方面監控PCR反應的進程。QS是已知拷貝數的人工構建核酸，與靶核酸序列相同，加入每一個樣本中，與樣本一同提取、擴增，根據標準品的擴增曲線對靶核酸進行定量，與國產試劑采用的傳統外標法定量相比，內標法完全消除由于核酸提取、擴增效率不同而造成的管間差異，定量結果更準確可靠，而且QS參與從核酸提取到熒光定量PCR整個實驗流程，可避免由于反應抑制造成的假陰性結果，也避免了溶血、脂血和黃疸等對PCR結果的干擾。基于這些特性，Cobas系統是精準度最高的病毒檢測儀，成為國際上檢測HBV DNA 的金標準。

根據以上研究結果，建議對于HBV DNA低于106copy/ml的標本，尤其是經過抗病毒治療后國產檢測低于檢測下限的，應采用Cobas高精度病毒載量檢測系統進行檢測或復測，避免假陰性結果而延誤病情，從而讓患者得到更有效、更有價值的治療，提高肝炎患者的治療效果和生活質量。