GAS5靶向miR-222-3p對牙周膜干細胞成骨分化的影響機制

郭燁 馬慶云 趙文麗 段風

1. 100190，北京市中關村醫院口腔科； 2. 陜西中醫藥大學第二附屬醫院口腔科；3. 西安醫學院第三附屬醫院口腔科

生長阻滯特異性轉錄因子5(growth arrest-special transcript 5，GAS5)是一個與牙周病有關的lncRNA，被報道在牙周炎患者中表達降低[1]。GAS5在骨髓間充質干細胞成骨分化過程中GAS5表達上調且發揮著促進成骨分化的作用[2]，然而其是否參與人牙周膜干細胞(hPDLSCs)成骨分化并不清楚。本研究旨在觀察GAS5在hPDLSCs成骨誘導前后的表達變化，并分析靶向干擾其表達對hPDLSCs成骨分化的作用機制。

1 材料與方法

1.1 基本材料

hPDLSCs(上海聯邁); DMEM完全培養基(深圳百恩維); GAS5-siRNA及陰性對照NC-siRNA(上海吉瑪); miR-222-3p模擬物、miR-222-3p抑制劑antimiR-222-3p(百奧邁科生物); 脂質體3000、Trizol試劑、茜素紅和雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(北京索萊寶)； psiCHENK2載體質粒(上海柯雷)；倒置顯微鏡(OLYMPUS，日本); CO2培養箱(上海博迅)； RT-PCR儀(Bio-Rad，美國)。

1.2 細胞培養與誘導分化

采用DMEM完全培養基在濕度飽和、37 ℃和5% CO2常規條件的培養箱內常規培養hPDLSCs；待貼壁生長至90%密度時，加入0.25%胰蛋白酶消化，并按照1 ∶4比例傳代。將第3代hPDLSCs接種至6孔板上，培養至80%匯合度時，將細胞分為對照組和誘導組，對照組細胞不做處理，而誘導組細胞以含10 nmol/L地塞米松、0.05 mmol/L維生素C和10 mmol/L β-甘油磷酸鈉的成骨誘導液培養。3 d換液/次，待培養14 d后采用RT-PCR檢測GAS5、Runx2、ALP和OCN表達。

1.3 細胞轉染

實驗分為： (1)未轉染組：正常培養； (2)NC-siRNA組：轉染NC-siRNA； (3)GAS5-siRNA組：轉染GAS5-siRNA； (4)GAS5-siRNA+antimiR-NC組：共轉染GAS5-siRNA和antimiR-NC；GAS5-siRNA+antimiR-222-3p組：共轉染GAS5-siRNA和antimiR-222-3p，其中，每組設3 個復孔。將hPDLSCs接種至6 孔板，培養至70%匯合度時，按照脂質體3000說明書對hPDLSCs進行瞬時轉染；轉染6 h后換液，培養48 h收集各組細胞，RT-PCR檢測GAS5和miR-223-3p表達水平評價轉染效率后，再以成骨誘導液培養。

1.4 茜素紅染色

待1.2和1.3中各組細胞成骨誘導14 d后，磷酸緩沖液將各組細胞洗滌2 遍。4%多聚甲醛固定25 min后，茜素紅染色15 min；洗去染液后，顯微鏡觀察拍照。

1.5 RT-PCR檢測

按照Trizol試劑說明書提取hPDLSCs總RNA后，紫外分光度計檢測RNA濃度；將RNA行逆轉錄后，根據2×SYBR Green PCR Mastermix說明書上RT-PCR儀進行擴增，U6和β-actin作為內參，2-ΔΔCt法計算GAS5、miR-222-3p、Runx2、ALP和OCN mRNA表達。

1.6 雙熒光素酶報告

基因實驗采用Starbase2.0軟件預測發現GAS5和miR-222-3p之間存在互補的結合位點。將野生和突變后的GAS5 3' UTR區克隆重組至psiCHENK2載體上，作為GAS5野生型(GAS5-WT)和突變型(GAS5-MUT)載體質粒；參照脂質體3000說明書將miR-223-3p模擬物、miR-NC分別與GAS5-WT、GAS5-MUT共轉染至hPDLSCs中，分別標記為miR-223-3p+GAS5-WT、miR-NC+GAS5-WT、miR-223-3p+GAS5-MUT、miR-NC+GAS5-MUT，每組設3 個復孔；轉染48 h后，根據試劑盒說明書檢測各組細胞的熒光素酶活性。

1.7 數據分析

2 結 果

2.1 成骨分化后GAS5表達上調

與對照組比較，誘導組hPDLSCs成骨誘導14 d后有鈣化結節形成(圖1)，Runx2(2.49±0.15vs1.00±0.00)、ALP(1.65±0.11vs1.00±0.00)和OCN(2.05±0.13vs1.00±0.00) mRNA表達升高且伴隨著GAS5(3.56±0.18

圖1 成骨誘導后PDSCs茜素紅染色結果 (×200)vs 1.00±0.00)表達上調(P<0.05)。

2.2 轉染后hPDLSCs中GAS5表達下調

與未轉染組比較，NC-siRNA組中GAS5表達差異無統計學意義(0.94±0.09vs1.00±0.00，P>0.05)；然而，GAS5-siRNA組中GAS5表達(0.19±0.04)較NC-siRNA組降低(P<0.05)。

2.3 GAS5低表達抑制hPDLSCs成骨分化

NC-siRNA組與未轉染組中鈣化結節程度無差異，而GAS5-siRNA組中鈣化結節程度較NC-siRNA組減輕(圖2)；與未轉染組比較，NC-siRNA組中Runx2(0.97±0.06vs1.00±0.00)、ALP(1.01±0.09vs1.00±0.00)、OCN(0.95±0.08vs1.00±0.00) mRNA表達差異均無統計學意義(P>0.05)；與NC-siRNA組比較，GAS5-siRNA組中Runx2(0.48±0.04)、ALP(0.66±0.04)、OCN(0.52±0.03) mRNA表達降低(P<0.05)。

2.4 GAS5與miR-222-3p模擬共轉染

GAS5與miR-222-3p之間存在互補的結合位點[3-4]； miR-222-3p模擬物和GAS5-WT共轉染后熒光素酶活性較miR-NC降低(0.29±0.03vs1.00±0.00，P<0.05)，但miR-222-3p模擬物和GAS5-MUT共轉染后熒光素酶活性和miR-NC相比(0.95±0.08vs1.00±0.00)差異無統計學意義(P>0.05)。

2.5 GAS5低表達上調hPDLSCs中miR-222-3p表達

NC-siRNA組和未轉染組中miR-223-p表達(1.02±0.09、1.00±0.00)差異均無統計學意義(P>0.05)；GAS5-siRNA組中miR-223-p表達(2.73±0.13)較NC-siRNA組升高(P<0.05)。

圖2 GAS5-siRNA處理后hPDLSCs茜素紅染色結果(×200)

2.6 下調miR-222-3p逆轉對GAS5低表達對hPDLSCs成骨分化的作用

與NC-siRNA組比較，GAS5-siRNA組中鈣化結節程度減輕，而miR-222-3p(2.89±0.15vs1.00±0.00)表達升高，而Runx2(0.45±0.03vs1.00±0.00)、ALP(0.59±0.03vs1.00±0.00)和OCN (0.50±0.04vs1.00±0.00)mRNA表達降低(P<0.05)；與GAS5-siRNA組比較，GAS5-siRNA+antimiR-NC組之間鈣化結節程度和miR-222-3p(2.95±0.19)以及Runx2(0.43±0.03)、ALP(0.61±0.04)和OCN (0.52±0.04)mRNA無明顯差異(P>0.05)；與GAS5-siRNA+antimiR-NC組比較，GAS5-siRNA+antimiR-222-3p組中鈣化結節程度加重(圖3)，miR-222-3p表達(1.17±0.09)降低，而Runx2(0.64±0.04)、ALP(0.82±0.06)和OCN(0.77±0.05)mRNA表達升高(P<0.05)(圖3)。

3 討 論

GAS5是一種腫瘤抑制和生長停滯相關的lncRNA，與多種干細胞自我更新和分化有關。GAS5可通過維持NODAL信號來促進人胚胎干細胞自我更新[5]，通過調控miR-18a/CTGF軸負向調控間充質干細胞的成脂分化[6]； 通過調節miR-135a-5p/FOXO1促進骨髓間充質干細胞的成骨分化[2]。然而，GAS5是否參與hPDLSCs成骨分化并不清楚。

ALP、Runx2和OCN是成骨分化的重要指標，其表達水平的高低可反映成骨分化能力的強弱[7]。本研究對hPDLSCs成骨誘導后發現，hPDLSCs有鈣化結節形成，同時ALP、Runx2和OCN mRNA以及GAS5表達升高。結果表明，hPDLSCs成骨分化后GAS5表達上調。這提示，GAS5可能在hPDLSCs成骨分化過程中發揮著重要作用。轉染GAS5-siRNA成功下調GAS5發現，hPDLSCs礦化結節能力減弱且ALP、Runx2、OCN mRNA表達降低。表明，下調GAS5表達可抑制hPDLSCs成骨分化。提示，在hPDLSCs成骨分化過程中GAS5發揮著積極作用。

圖3 GAS5-siRNA+antimiR-222-3p處理后hPDLSCs茜素紅染色結果(×200)

lncRNA可通過競爭性結合miRNA靶基因mRNA的3'-非編碼區域間接抑制miRNA對mRNA的調控作用，還可作為競爭性內源RNA發揮海綿吸附作用抑制miRNA的表達[8]。本研究采用Starbase2.0軟件預測發現GAS5和miR-222-3p之間存在互補的結合位點。miR-222-3p低表達可通過IGF-1/ERK途徑和Smad5-Runx2信號軸促進骨髓間充質干細胞成骨分化[9-10]。雙熒光素酶報告基因實驗證實GAS5可與miR-222-3p靶向結合；另外，在GAS5低表達的hPDLSCs中發現miR-222-3p表達升高。進一步下調miR-222-3p表達后發現，GAS5低表達對hPDLSCs成骨分化的抑制作用減弱。這表明，GAS5可通過靶向miR-222-3p調控hPDLSCs成骨分化。

綜上，hPDLSCs成骨分化后GAS5表達上調，下調GAS5表達可通過靶向調控miR-222-3p抑制hPDLSCs成骨分化。