QDA和GC-MS結合PLSR分析寧紅茶中的風味物質

岳翠男,秦丹丹,蔡海蘭,李琛,王治會,李文金,楊普香*,吳華玲*

1(江西省蠶桑茶葉研究所,江西 南昌，330202)2(江西省茶葉質量與安全控制重點實驗室,江西 南昌，330202) 3(廣東省農業科學院 茶葉研究所,廣東 廣州， 510640)

寧紅是我國獨特且最早的傳統工夫紅茶之一，創始于清道光年間，江西修水古稱義寧州，所產紅茶稱寧州工夫紅茶，簡稱“寧紅”，歷史上修水、武寧、銅鼓三縣為同一個縣因此這三個縣所產紅茶均稱寧紅[1]。當代茶圣吳覺農先生曾說：“寧紅是歷史上最早支派，早于祁紅九十年，先有寧紅，后有祁紅，寧紅祁紅并稱世界之首”[2]。寧紅茶品質特征描述主要包括條索緊結圓直，鋒苗挺拔，色烏光潤，內質香高持久似祁紅，滋味醇厚甜和，湯色紅亮，葉底紅勻等詞匯[1-2]，這些術語尚不能準確的表達其內質特征，同時關于影響其品質特征的化學成分尚未見報道。

香氣是茶葉品質的重要貢獻因子,消費者聞香而識茶[3-4]。定量描述分析法(quantitative description analysis,QDA)可以對產品的特征特性進行全面描述、定義和評價,從而讓消費者更加準確的了解產品的特點[5-6],目前相關學者已采用定量描述分析法對蘭花香綠茶[7]、板栗香綠茶[8]、工夫紅茶[9]等的香氣進行了準確定義與評價。香氣成分的測定可通過氣相色譜質譜(GC-MS)進行定性和定量[10],目前已成為茶葉香氣研究的重要手段,相關學者使用該方法測定了祁紅[11]、川紅[9]、滇紅[12]、閩紅[13]等的香氣含量,并分析出了其主要呈香物質。基于此,本研究擬采用感官評價方法與GC-MS相結合對寧紅茶的香氣特征與揮發性成分進行檢測分析,采用偏最小二乘法(partial least squares regression,PLSR)篩選出對寧紅茶香氣具有重要貢獻的揮發性成分,以期為寧紅茶的加工品質調控提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試的8份寧紅茶樣品分別采購于修水縣內的4個茶廠,茶樣制作的鮮葉采用不同的芽葉等級,制作工序為寧紅傳統工夫紅茶加工工序,分為萎調→揉捻→發酵→干燥→提香。每個樣品用相同規格的專用鋁箔袋包裝,置于-4 ℃的冰箱中備用。

1.2 實驗方法

1.2.1 感官定量描述分析

香氣術語及定義的產生：稱取3 g茶樣放于審評杯中,注入150 mL沸水,沖泡5 min后瀝出茶湯,之后由6名具備評價資格的茶學專業人員組成的評價小組對茶湯進行香氣描述,記錄香氣術語,之后對術語進行討論與定義,并結合相關文獻刪除重復的與描述不清晰的詞匯[14-15],最終篩選出的香氣術語及定義見表1。

樣品感官評價：茶湯制備方法與上述相同,評價小組依據建立的香氣術語及定義,采用1～15的強度尺度對寧紅茶樣進行感官評價,強度尺度1～3為極弱、3～5為較弱、5～7為弱、7～9為中、9～11為強、11～13為較強、13～15為極強,評價人員在最能反映樣品感官強度的位置進行標記。

表1 香氣術語及定義Table 1 Terms and definitions of aroma

1.2.2 揮發性物質測定

樣品前處理：采用HS-SPME法萃取樣品的揮發性物質,稱取1.5 g粉碎后的茶樣,轉移至20 mL頂空進樣瓶中,加入20 μL癸酸乙酯(0.02 mg/mL),加入沸蒸餾水5 mL。HS-SPME的萃取條件：在60 ℃恒溫條件下振蕩15 min,振蕩速度為450 r/min(5 s開,2 s關),50/30 μm DVB/CAR /PDMS萃取頭(sigma公司)插入樣品頂空部分,頂空萃取60 min,于250 ℃下解析5 min,然后進行GC/MS分離鑒定。萃取頭Fiber萃取前在Fiber Conditioning Station 中老化2 h,采樣前后分別在Fiber Conditioning Station中加熱解吸去雜10 min。

GC/MS分析條件：采用Agilent 7890B-5977B(GC-MS)PAL RSI 120進行揮發性物質分析。色譜條件：DB-WAX毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm,Agilent J&W Scientific,Folsom,CA,USA),載氣為高純氦氣(純度不小于99.999%),恒流流速1.0 mL/min,進樣口溫度260 ℃,不分流進樣,溶劑延遲1.5 min。程序升溫：40 ℃保持3 min,以4 ℃/min升至220 ℃,保持10 min。質譜條件：電子轟擊離子源(EI),離子源溫度230 ℃,四極桿溫度150 ℃,質譜接口溫度280 ℃,電子能量70 eV。檢測器電壓：901V,掃描方式為全掃描模式(SCAN),質量掃描范圍：m/z20～650。每個樣品重復3次。

GC/MS定性：將各色譜峰的質譜圖在鹿明生物自主研發的LUG數據庫Lumingbio進行相似度比對,獲得定性化合物。GC/MS定量：采用內標癸酸乙酯定量分析香氣成分,各揮發性成分含量按公式(1)計算：

揮發性成分含量/(μg·kg-1)=

(1)

1.3 數據處理

采用Origin 2018制作雷達圖與百分比圖,采用SPSS 19.0進行因子分析,采用J.Craig Venter Institute研發的Multiple Experiment Viewer 4.9.0進行熱圖分析,PLSR采用The Unscrambler Version 9.7進行分析。

2 結果與分析

2.1 寧紅茶香氣特征分析

2.1.1 香氣特征的剖面分析

對寧紅茶香氣感官定量描述分析結果進行剖面,如圖1所示。寧紅茶的香氣分屬性中以果香強度最強,甜香和花香次之,說明寧紅茶的主要呈香表征為以果香為主,甜香和花香為輔,這是寧紅茶的典型感官特性。這與前人所報道的寧紅茶具有“蘋果香”、甜香高長、內質香高持久、以及具有類似祁紅香氣等的描述相符合[1-2]。

圖1 香氣特征剖面圖Fig.1 Aroma profile of tea samples

變異系數為標準差與平均值之比,是樣本分散程度的一個歸一化量度,數值越大說明離群點越多,樣本之間的差異性越大[16]。3個典型感官屬性中,果香和甜香的變異系數相對較小,分別為16.9%和19.1%,花香的變異系數相對較大,為31.3%,可以看出果香和甜香在寧紅茶香氣中的強度差異性相對較小,而花香的差異性相對較大,離群點多,也從側面說明了寧紅茶的果香和甜香品質特征較為穩定,為其基礎性香型,而相對來說花香的改良潛力更大,在寧紅茶制作中,可以通過改良其花香強度,來進一步提升寧紅茶品質。焙烤香、木香、辛香、清香對寧紅茶的香氣強度具有貢獻,但整體強度相對較弱,此4種香氣分屬性中,焙烤香的變異系數為24.2%,說明樣本的焙烤香存在差異性,但離群點不多；辛香和清香的變異系數均為31.9%,樣本之間的差異性較大；木香的變異系數達到82.7%,原因在于寧紅茶大部分樣本木香強度較弱,但No.3和No.4樣品的木香強度較強,產生了分散的離群點。異氣的變異系數為36.7%,說明寧紅茶樣本的異氣差異性較大,存在制作不良的問題,異氣包括大量對茶葉品質存在負面影響的香氣類型,如發酵味、煙味、焦糊味等[14],在制作寧紅茶時,應盡可能減少異氣的產生,提升其他香型的強度,以發揮寧紅茶的品質特征。

2.1.2 香氣特征的因子分析

因子分析法是從研究指標相關矩陣內部的依賴關系出發,把一些信息重疊、具有錯綜復雜關系的變量歸結為少數幾個不相關的綜合因子的一種多元統計分析方法,與主成分分析相比,其重在解釋原始變量之間的關系,經提取公因子,使潛在因子實際意義更加明確[17]。對寧紅茶香氣感官評價結果進行因子分析,結果見圖2。

圖2 因子分析的載荷圖Fig.2 Loading diagram of factor analysis

前3個因子的初始特征值大于1,累計方差貢獻率達到78.5%,說明因子分析的前3個因子可以解釋寧紅茶香氣特征的78.5%的信息,能夠代替8個香氣分屬性進行分析。第1因子的方差貢獻率為35.8%,主要表征甜香、花香和清香；第2因子的方差貢獻率為25.6%,主要表征果香、焙烤香、木香和辛香；第3因子的方差貢獻率為17.1%,主要表征異氣,由此可以看出,8個香氣分屬性在各因子中均有貢獻,說明寧紅茶的香氣感官品質可用此8個分屬性進行評價,能夠代替其78.5%的感官變異。在因子分析中,2個變量之間的距離越近,說明兩者之間的相關性越大,在因子分析中同一圓圈內的變量即表示相關性較大。寧紅茶的花香和甜香之間、焙烤香和果香之間、辛香與清香之間相關性較大,木香和異氣距離其他香氣分屬性均較遠,與各分屬性之間相關性不大,這是寧紅茶的典型感官特性。與毛世紅等[15]對中國工夫紅茶風味研究的結論一致，即花香和甜香間呈顯著正相關,原因在于工夫紅茶中很多揮發性成分的呈香特性既有甜香又有花香,異氣、辛香與其他香氣分屬性相關性不顯著。

2.2 寧紅茶揮發性化合物含量分析

2.2.1 揮發性化合物含量的描述統計

對寧紅茶樣品的揮發性化合物的檢測結果進行描述性統計,結果見圖3和圖4。

圖3 揮發性成分占總香氣成分的百分比Fig.3 Percentage of volatile components in total aroma components

8個寧紅茶樣品中共檢測到74個共有揮發性成分,包括醇類20種、醛類9種、酮類8種、酸類6種,酯類12種,萜烯類3種、碳氫化合物9種和雜環類7種。醇類含量最高,占樣品揮發性成分總量的58%～70%,其次為脂類,占比10%～16%,再其次是酸類(5%～17%)、醛類(4%～7%)、酮類(2%～5%)、碳氫化合物(3%～4%)、雜環類(1%～4%)和萜烯類(1%左右)。王秋霜等[18]鑒定國內名優紅茶的香氣成分,鑒定出約60種香氣化合物,主要包含醇類、酯類、醛類、酮類和烯類、烷烴類等,認為醇類是國內名優紅茶香氣中最主要的物質,其次是酯類和醛類；羅學平等[19]對紅茶香氣成分進行鑒定,發現主要成分包含醇類、醛類、酯類、酮類、烴類、酸類等,其主要的香氣貢獻成分是醇類化合物,相對含量在45.97%～63.78%；雷攀等[20]對不同區域祁紅的香氣進行分析,共鑒定出50多種揮發性化合物,主要為醇類、酸類和醛類,分別占香氣相對總量的30.52%～49.13%、22.84%～38.52%和10.37%～16.15%。與前人的研究結果相比,寧紅茶的香氣成分也以醇類含量為最高,且比其他工夫紅茶的占比更大,其他類型的香氣成分含量占比存在較大差異,這是寧紅茶品質特征與其他紅茶存在差異的主要原因。

2.2.2 揮發性化合物的熱圖分析

寧紅茶樣品檢測的74個共有揮發性成分的熱圖分析結果見圖4。

圖4 各樣品揮發性成分熱圖分析Fig.4 Heatmap analysis of volatile components in each sample

從每個茶樣揮發性物質熱圖的顏色深淺對比看,No.5和No.4的揮發性成分香氣含量明顯較高,其次為No.7和No.2,再其次為No.3、No.6和No.1,最后是No.8。其中No.5、No.4、No.7和No.2的揮發性成分大部分高于均值,呈紅色,而No.3、No.6、No.1和No.8大部分低于均值,呈綠色。揮發性成分中含量最大是香葉醇,其次為苯乙醇,之后是苯甲醇、芳樟醇、反式芳樟醇氧化物和水楊酸甲酯。在對無性系紅茶的揮發性化合物的分析中發現中國類型茶樹鮮葉制作的紅茶以香葉醇居多,阿薩姆類型的以芳樟醇居多,而大吉嶺、云南紅茶屬于中間型[21]。中國紅茶中,祁紅和福建紅茶的香葉醇含量高,兩廣地區紅茶芳樟醇及其氧化物含量高。按香氣特征，紅茶可分為3種類型,第1種是以芳樟醇及其氧化物占優勢型,第2種是中間型,以芳樟醇和香葉醇為主,第3種類型是以香葉醇占優勢型[21]。綜合來看,寧紅茶在主要香氣成分含量上和我國其他工夫紅茶相近,在分類上屬于第3種。其中香葉醇的呈香特性為玫瑰花香、甜香,苯乙醇的呈香特性為玫瑰花香、蜜香,苯甲醇為芳香、果香,芳樟醇及反式芳樟醇氧化物呈花香、木香,水楊酸甲酯呈清香、花香[22-23]。從含量較大的揮發性成分呈香特性來看,基本呈現甜香、花香、果香等特征,和前面寧紅茶感官評價結果較為一致。從每個揮發性成分在各茶樣中的熱圖來看,整體的顏色差異性較大,變異系數為19.8%～117.7%,其中呈果香和甜香的丁酸二甲基芐基原酯、β-水芹烯、檸檬醛、雙戊烯、香葉醇、苯甲醇等的變異系數相對較低,均在30%以下,呈典型花香、清香和木香等的芳樟醇、反式芳樟醇氧化物、β-柏木烯、β-紫羅酮和(Z)-2-戊烯-1-醇等的變異系數在30%以上,與前面寧紅茶的香氣分屬性變異較為一致,說明寧紅茶的香氣特征以及差異是由揮發性化合物的組成所決定的。

2.3 寧紅茶香氣特征關鍵貢獻化合物的篩選

以寧紅茶揮發性化合物為X變量,香氣感官分屬性為Y變量,采用PLSR對寧紅茶樣品的揮發性成分與香氣感官分屬性進行多自變量多因變量(PLS2)分析。所建立的PLSR模型提取的3個主成分,解釋了92%的交叉驗證方差,說明該模型能夠成功地反映樣品的整體信息。揮發性化合物與香氣感官指標的相關性載荷圖見圖5。

圖5 各變量在PLSR上的載荷分布Fig.5 Load distribution of variables on PLSR

有5個感官指標和46個化學成分落在2個橢圓(R2=0.5 和R2=1.0)之間,分別代表50%和100%的解釋方差, PLSR模型能夠很好地解釋這些指標[24]。說明此46個揮發性化合物決定了寧紅茶樣品的香氣特征,分別為5-甲基-2-乙酰基呋喃、2-正戊基呋喃、反式-橙花叔醇、正己醇、橙花醇、糠醇、苯甲醇、香葉醇、芳樟醇、苯乙醇、百里酚、β-環檸檬醛、(E,E)-2,4-庚二烯醛、3-糠醛、苯甲醛、2,5-二甲基苯甲醛、檸檬醛、正己醛、反式-3-己烯酸、苯甲酸、己酸、正戊酸、β-紫羅酮、α-紫羅酮、2-環戊烯酮、2-庚酮、植酮、香葉基丙酮、1-甲基萘、奧苷菊環、β-水芹烯、羅勒烯、β-柏木烯、二氫獼猴桃內酯、3-己烯酸乙酯、庚酸乙酯、棕櫚酸乙酯、正己酸乙酯、(Z)-2-戊烯-1-醇、Z-3-己烯-1-醇、(Z)-己酸-3-己烯酯、水楊酸甲酯、羥基丙酮、呋喃酮、二氫芳樟醇、茉莉酮。根據PLSR模型中各揮發性成分在主成分上的載荷值來提取關鍵貢獻成分,其中有16個揮發性化合物的載荷值在0.7以上,分別為α-紫羅酮、香葉醇、反式-橙花叔醇、β-水芹烯、羅勒烯、苯乙醇、苯甲醛、芳樟醇、β-紫羅酮、橙花醇、棕櫚酸乙酯、3-糠醛、苯甲醇、己酸、反式-3-己烯酸、水楊酸甲酯,說明這16個揮發性化合物對寧紅茶香氣的貢獻最大。16個揮發性化合物中α-紫羅酮、香葉醇、反式-橙花叔醇、β-水芹烯、羅勒烯、苯乙醇、苯甲醛、芳樟醇、β-紫羅酮、橙花醇、棕櫚酸乙酯、3-糠醛、苯甲醇和水楊酸甲酯的呈香特性主要包括果香、花香、甜香、木香、清香和奶香等不同類型[25-26],對寧紅茶的品質特征均具有正貢獻,這些成分是寧紅茶果香、甜香和花香的基本構架；而反式-3-己烯酸和己酸的呈香特征為刺激的乙酸試劑味和椰肉油氣味等[14-15,27],對寧紅茶的品質特征具有負貢獻,可能是部分樣品異味產生的主要來源。王秋霜等[18]對國內的名優紅茶香氣進行分析,發現水楊酸甲酯、橙花醇、芳樟醇、氧化芳樟醇是最主要的呈香物質；毛世紅等[15]對工夫紅茶的香氣成分進行風味組學分析,發現橙花叔醇、苯甲醛、苯乙醛、芳樟醇、苯乙醇、(E)-β-紫羅蘭酮環氧化合物、水楊酸甲酯、苯甲醇、脫氫芳樟醇、香葉醇、棕櫚酸甲酯和芳樟醇氧化物是其基本香氣骨架。李小嫄等[14]對國內工夫紅茶的香氣成分進行分析,發現橙花醇、羅勒烯、芳樟醇及其氧化物、月桂烯、橙花叔醇、香葉醇、檸檬烯、香葉基丙酮、反-2-壬烯醛、1-辛烯-3-醇、苯乙醇、水楊酸甲酯、α-萜品醇、β-環檸檬醛、異丁醛為關鍵呈香成分。與本研究發現的寧紅茶在香氣關鍵貢獻成分上主要成分基本相同,而β-水芹烯、棕櫚酸乙酯、3-糠醛、己酸、反式-3-己烯酸與目前已報道的結果存在差異,其原因有待進一步探討。

3 結論與討論

本研究對寧紅茶感官特性與揮發性成分進行分析,主要結論如下：(1)采用定量描述分析法建立了寧紅茶的香氣描述系統,包括8個描繪詞及其定義,該系統可以解釋寧紅茶香氣變異的78.5%信息,其典型感官特性為以果香為主,甜香和花香為輔,變異系數顯示果香和甜香在寧紅茶香氣中的強度差異性相對較小,其他6個屬性的差異性較大,說明改良潛力較大。各香氣分屬性中花香和甜香之間密切相關,焙烤香和果香之間密切相關,辛香與清香之間密切相關,木香和異氣與其他各分屬性之間無相關性。(2)GC-MS共鑒定出74個共有揮發性成分,其中包括醇類20種、醛類9種、酮類8種、酸類6種,酯類12種,萜烯類3種、碳氫化合物9種和雜環類7種,以醇類含量最高,之后依次為酯類、酸類、醛類、酮類、碳氫化合物、雜環類和萜烯類。熱圖分析顯示各樣品之間的揮發性含量差異性較大,其中以香葉醇含量最高,按照文獻[21]中的分類，寧紅茶屬于以香葉醇占優勢型的工夫紅茶。(3)PLSR模型結果顯示提取的46個揮發性成分變量能夠解釋寧紅茶香氣變異的92%信息,說明此46個揮發性化合物決定了寧紅茶樣品的香氣特征,依據載荷貢獻最終篩選出了16個關鍵貢獻揮發性化合物,分別為α-紫羅酮、香葉醇、反式-橙花叔醇、β-水芹烯、羅勒烯、苯乙醇、苯甲醛、芳樟醇、β-紫羅酮、橙花醇、棕櫚酸乙酯、3-糠醛、苯甲醇、己酸、反式-3-己烯酸和水楊酸甲酯。其中反式-3-己烯酸和己酸為負貢獻,其他14種為正貢獻。因此,在寧紅茶加工過程中,應最大可能的增加正貢獻的揮發性化合物的含量,減少負貢獻化合物的含量,進一步研究將集中在加工過程中寧紅茶關鍵貢獻香氣成分的代謝途徑及其調控機制,為寧紅茶的品質定向調控提供基礎。