可溶性微纖維相關蛋白4、白三烯D4及干擾素γ對兒童哮喘篩查及病情評估價值比較

施芬，羅漢清(武漢市中心醫院新洲院區&武漢市新洲區人民醫院兒科，武漢 430400)

兒童哮喘診斷和病情嚴重程度的判斷主要依據臨床癥狀和肺功能，在診斷和治療上缺乏特異性標志物。炎癥和免疫反應、細胞和細胞外基質間的相互作用與支氣管哮喘進展關系密切，檢測相關標志物不僅輔助哮喘的診斷，而且可深入探討哮喘發作時的炎癥細胞和細胞因子的調控機制[1]。白三烯D4(LTD4)和干擾素γ(IFN-γ)是臨床上對哮喘發作及嚴重程度評估常用的診斷標志物[2]，但二者的特異性及敏感性不高。尋找更特異的兒童哮喘診斷標志物對提高兒童哮喘診治水平具有重要的意義。微纖維相關蛋白4(microfibrillar-associated protein 4, MFAP4)是一種屬于纖維蛋白原相關蛋白超家族的細胞外基質蛋白，在先天免疫和內皮細胞功能的發揮過程中起重要的作用[3]。研究顯示，MFAP4可調節支氣管平滑肌細胞增殖并促進氣道嗜酸性粒細胞增多，氣道高反應性和肺重塑并促進過敏性哮喘的發生[4]。可溶性微纖維相關蛋白4(soluble microfibrillar-associated protein 4, sMFAP4)是一種分泌蛋白質，以可溶性形式存在于外周循環中[5]。本研究通過檢測哮喘患兒和健康兒童中sMFAP4、LTD4和IFN-γ的表達水平，旨在分析其對兒童哮喘篩查及病情評估的價值。

1 材料和方法

1.1一般資料 納入武漢市新洲區人民醫院兒科2019年1月至12月收治的哮喘患兒100例為哮喘組，其中包括哮喘發作期患兒50例，其中男30例，女20例，年齡(8.9±2.7)歲。診斷均依據中華醫學會兒科學分會呼吸學組修訂《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南》標準診斷[6]。兒童哮喘嚴重程度標準依據“全球哮喘防治創議”(GINA方案)進行[7]。50例急性發作期患兒中，哮喘輕度發作21例，中度發作24例，重度發作5例，以及哮喘緩解期患兒50例。納入標準:(1)年齡4～12歲；(2)首次哮喘發作；(3)支氣管哮喘發作診斷明確，患兒存在急性發作期和臨床緩解期的臨床資料；(4)入選兒童在72 h內未使用糖皮質激素、β2受體激動劑、抗膽堿能類、抗組胺、白三烯拮抗劑及茶堿類藥物。排除標準：(1)不符合上述納入標準；(2)患者臨床資料和隨訪資料不全的患者；(3)患者家屬拒絕參與研究者。選擇同期年齡和性別相匹配的體檢健康兒童50例為健康人對照組，其中男29例，女21例，年齡(8.8±2.3)歲。哮喘組患兒與健康人對照組兒童年齡和性別比較，差異無統計學意義(χ2分別為14.36,18.36，P均>0.05)。所有患兒發作后均收入院經規則聯合吸入糖皮質激素(inhaled corticosteroids，ICS)/長效β2受體激動劑(long-acting beta2 agonists，LABA)治療后哮喘緩解。本研究經武漢市新洲區人民醫院醫學倫理委員會批準(No.WHXZ-P-20190112),各研究對象均簽署知情同意書。

1.2主要儀器及試劑 sMFAP4、白三烯D4(LTD4)和干擾素γ(IFN-γ)酶聯免疫試劑盒(武漢優爾生科技股份公司)，Stat Fax-2100型酶聯儀(美國Awareness公司)，TGL-16M臺式高速離心機(濟南博科公司)，乙二胺四乙酸二鉀抗凝管(沈陽寶康生物公司)。

1.3方法

1.3.1血液樣本收集 于哮喘患兒急性發病入院時，臨床緩解期于隨訪期間，采集患兒空腹靜脈血樣本，健康人對照組兒童在體檢當日清晨采集外周血 5 mL，4 ℃、1 500×g離心10 min，取上清液，采用乙二胺四乙酸二鉀抗凝管收集，置于-80 ℃凍存待測。

1.3.2ELISA法測定血清sMFAP4、LTD4和IFN-γ濃度 按照人sMFAP4、LTD4和IFN-γ ELISA試劑盒說明書檢測哮喘組和健康人對照組血清中sMFAP4、LTD4和IFN-γ濃度。采用Stat Fax-2100型酶聯儀在450 nm波長處依次測量各孔的吸光度(A450 nm值),并計算sMFAP4、LTD4和IFN-γ濃度。參考范圍：LTD4：2～10 ng/mL，sMFAP4：1～2 ng/mL，IFN-γ：70～120 ng/mL。

2 結果

2.1各組血清sMFAP4、LTD4和IFN-γ濃度比較 哮喘患兒急性發作期血清sMFAP4濃度及LTD4濃度顯著高于健康人對照組和哮喘緩解期患兒(P<0.05)，但哮喘患兒急性發作期血清IFN-γ 濃度顯著低于健康人對照組和緩解期患兒(P=0.001)。見表1。

表1 各組血清sMFAP4、LTD4和IFN-γ濃度比較(ng/mL)

2.2各指標對兒童哮喘的篩查效能比較 以兒童哮喘診斷標準為金標準，選取哮喘患兒為實驗組，健康兒童為對照組，將實驗組和對照組sMFAP4、IFN-γ、LTD4濃度納入ROC曲線分析，評估sMFAP4、IFN-γ及LTD4及聯合檢測篩查兒童哮喘的效能。ROC曲線分析結果表明，血清sMFAP4濃度篩查兒童哮喘癥的ROC曲線下面積(area undercurve，AUCROC)顯著高于IFN-γ及LTD4，而聯合檢測sMFAP4、IFN-γ、LTD4篩查兒童哮喘癥的AUCROC亦顯著高于單項指標。見表2、圖1。

表2 血清sMFAP4、IFN-γ、LTD4對兒童哮喘癥的篩查價值比較

圖1 血清sMFAP4、IFN-γ、LTD4對兒童哮喘癥篩查價值的ROC曲線

2.3各指標區分兒童哮喘急性發作期和臨床緩解期的效能比較 以兒童哮喘急性發作期診斷標準為金標準，選取哮喘急性發作期兒童為實驗組，以哮喘臨床緩解期患兒為對照組，將實驗組和對照組sMFAP4、IFN-γ、LTD4濃度納入ROC曲線分析，評估sMFAP4、IFN-γ及LTD4及聯合檢測區分兒童哮喘急性發作期和臨床緩解期的效能。血清sMFAP4區分兒童哮喘急性發作期和臨床緩解期的AUCROC高于IFN-γ、LTD4，聯合檢測sMFAP4、IFN-γ、LTD4區分兒童哮喘急性發作期和臨床緩解期的AUCROC高于單項指標。見表3、圖2。

表3 血清sMFAP4、IFN-γ、LTD4篩查兒童哮喘急性發作期和臨床緩解期的效能比較

圖2 血清sMFAP4、IFN-γ、LTD4區分兒童哮喘急性發作期和臨床緩解期的ROC曲線

3 討論

哮喘發作和嚴重程度常用的臨床診斷標志物包括LTD4和IFN-γ等[2]。LTD4是哮喘發病過程中的炎癥介質，在哮喘發病中促進炎性反應細胞聚集，并促進氣道高反應性。本研究結果發現，哮喘急性發作期患兒LTD4濃度高于哮喘緩解期患兒及健康人對照組，這與劉芳君等[8]研究結果相一致。

在哮喘發病過程中，T細胞激活和細胞免疫發揮關鍵作用，TH1/TH2細胞平衡紊亂是哮喘發病機制之一[9]。哮喘發作時，TH2型細胞因子過度分泌，TH1細胞分化減少，繼而由TH1細胞分泌的IFN-γ濃度顯著降低，故而IFN-γ濃度在哮喘患者中下降明顯[10]。本研究亦發現哮喘急性發作期IFN-γ濃度顯著低于哮喘緩解期及健康人對照組。

MFAP4是種細胞外基質蛋白，屬于纖維蛋白原相關蛋白超家族，在富含彈性蛋白的組織(如心臟和肺)中呈高表達[3,11-12]，MFAP4基因定位于12q15上，以膜蛋白和可溶性(sMFAP4)形式存在于機體[12]。另有研究發現，急性心肌梗死患者循環中sMFAP4顯著增加[5]；且MFAP4是肝臟和肺纖維化的潛在標志物[13]。sMFAP4在支氣管哮喘發病及進展中扮演著重要的角色。sMFAP4可促進支氣管平滑肌細胞增殖及嗜酸性粒細胞趨化因子分泌，進而促進氣道嗜酸性粒細胞增多、氣道高反應性及肺重構，誘導過敏性哮喘的發生[13]。Pilecki等[14]發現，在卵清蛋白誘導的小鼠過敏性哮喘動物模型中，sMFAP4在支氣管平滑肌細胞中表達增加，并與α1β3整合素受體結合，促進支氣管平滑肌細胞增殖和遷移。Johansson等[15]報道慢性阻塞性肺病患者血清sMFAP4濃度與慢阻肺病情嚴重程度及急性發作呈正相關。本研究發現，哮喘患兒血清中sMFAP4濃度高于健康人對照組，同時哮喘急性發作期水平高于臨床緩解期，提示MFAP4參與哮喘發病過程，其表達變化可通過檢測外周循環中sMFAP4變化水平而反映出來。本研究結果與文獻[16]報道基本一致，其研究證實在成人哮喘患者中，輕度和重度哮喘患者血清sMFAP4濃度高于健康對照者，其表達水平改變與患者是否接受β2受體激動劑治療無關。

血清中sMFAP4濃度具有良好的篩查兒童哮喘及區分急性發作期和臨床緩解期的臨床效能，血清sMFAP4濃度篩查兒童哮喘及區分急性發作期和臨床緩解期的AUCROC、敏感性及特異性均高于LTD4 和IFN-γ，顯示出良好的臨床篩查及評估病情嚴重程度的效能，有望成為兒童哮喘無創輔助診斷及病情判斷標志物。筆者進一步分析發現，sMFAP4、LTD4 和IFN-γ 三者聯合應用篩查兒童哮喘及區分急性發作期和臨床緩解期的AUCROC、敏感性及特異性均高于單項指標檢測，提示聯合檢測上述標志物可提高兒童哮喘的篩查及對兒童哮喘病情評估價值。本研究亦存在一定的不足之處，如未能分析sMFAP4與不同程度哮喘的急性發作存在何種程度的關系，以及未進一步明確sMFAP4與呼吸功能、白細胞及IgE的關系如何，值得進一步研究。