miR-2861在食管鱗癌患者血清中的表達及臨床意義

史露賓，李世寶，彭晴，毛逸琪，馬萍(.徐州醫科大學醫學技術學院，江蘇徐州000；.徐州醫科大學附屬醫院檢驗科，江蘇徐州000)

中國作為食管癌高發地區之一，發病率和死亡率均高于世界平均水平[1]。根據其組織來源不同，可將其分為食管鱗癌(ESCC)和食管腺癌(EAC)，在我國ESCC患者占比超過90%，且預后較差，5年生存率不足20%[2]。癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、糖類抗原19-9(carbohydrate antigen19-9，CA19-9)作為目前臨床上常用的食管癌的診斷和預后標志物，其敏感性和特異性均較低。因此，急需一種敏感性較高且容易獲得的新型標志物以提高ESCC早期檢出率。研究證實，miR-2861在多種腫瘤中發揮著重要的作用，例如乳頭狀甲狀腺癌[3]，宮頸癌[4]，肺癌[5]等。然而，其在食管癌中的報道少見。本研究檢測了miR-2861在ESCC患者血清中的表達水平，分析了其與患者臨床病理參數的關系，并且評估其對ESCC的診斷效能，以期為ESCC診斷提供新的腫瘤標志物。

1 材料與方法

1.1一般資料 收集2018年9月至2019年6月徐州醫科大學附屬醫院消化內科、胸外科就診的食管癌患者49例，男41例，女8例，年齡(66.0±8.4)歲。納入標準：(1)均經病理組織活檢證實為ESCC；(2)入組前未經手術、放療、化療等治療；(3)臨床資料完整。排除標準：(1)合并其他腫瘤者；(2)患有嚴重心、肺、腎、神經系統等疾病；(3)患有嚴重精神疾病者。臨床分期：按國際抗癌聯盟 (UICC)第七版TNM標準分期分為T1/T2期24例，T3/T4期25例；腫瘤大小：≥5 cm 22例，<5 cm 27例；存在淋巴結轉移21例，無淋巴結轉移28例；存在神經侵犯21例，無神經侵犯28例；分化程度：高分化18例，中、低分化31例；腫瘤標志物(包括CEA、CA19-9、CA125、CA72-4、SCCA)升高：是15例，否34例。收集同期于本院消化內科就診的食管良性疾病(主要為食管良性腫瘤、食管炎)患者36例，患者均經內鏡檢查確診，男31例，女5例，年齡(52.9±12.6)歲；另收集同期在本院體檢健康者48例作為健康人對照組，男39例，女9例，年齡(66.8±7.8)歲，各組的年齡、性別差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經徐州醫科大學附屬醫院醫學倫理委員會批準(XYFY2021-JS004-01)，患者均知情同意。

1.2主要儀器及試劑 TRIzol Universal總RNA提取試劑(北京天根生化科技公司)，逆轉錄試劑盒(上海同科生物科技公司)，PCR試劑盒(廣州銳博生物技術公司)。Applied Biosystems ABI 7500型定量PCR儀(美國ABI公司)，NanoDrop 1000分光光度計(美國Thermo公司)。

1.3標本采集 使用含有分離膠的促凝采血管采集各研究對象住院時(體檢健康者于體檢時采集)的空腹靜脈血5 mL，2 h內于4 ℃、4 000 r/min離心10 min，吸取上層血清，置于無RNase的EP管中，樣本置-80 ℃保存。

1.4RNA提取及逆轉錄反應 按照TRIzol Universal總RNA提取試劑說明書提取血清總RNA，紫外分光光度計檢測及濃度及純度，選取吸光度(A260/280 nm)在1.8～2.0的樣本用于后續實驗。按照逆轉錄試劑盒說明書將RNA逆轉錄為cDNA，標本置于-20 ℃保存。

1.5引物設計及實時熒光定量PCR 根據GenBank中miR-2861和內參U6基因的序列號(分別為NR_037217和NR_138085)，用Primer Premier 5.0軟件設計引物，并送廣州銳博生物技術公司合成[6]。miR-2861上游引物序列：5′-CCTCTGCAGCTCCGGC-3′，下游引物序列：5′- CTCTTCCGGTCTCCGCCC-3′，退火溫度60 ℃，產物片段大小82 bp。U6上游引物序列：5′-TAGGGAGACAGGGTGCTGAA-3′，下游引物序列：5′-AAAGCCCTTCAGGATACCGC-3′，退火溫度60 ℃，產物片段大小94 bp。熒光定量PCR反應體系為20 μL，包括：2×SYBR Green Mix 10 μL，上、下游引物各0.8 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 6.4 μL。循環參數：95 ℃預變性10 min；95 ℃ 2 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 34 s，共50個循環。用PCR儀配套的LightCycler?96分析軟件在70～95 ℃采集熒光信號。每個樣本設置3個復孔，以U6為內參照。結果以Ct值表示，miR-2861的相對表達水平以2-△△Ct法計算。公式：ΔΔCt=[(實驗組Ct目的基因-實驗組Ct內參基因)-(健康人對照組Ct目的基因-健康人對照組Ct內參基因)]。

2 結果

2.1miR-2861在各組血清樣本中的表達水平 miR-2861在49例ESCC患者(8.34±7.81)、36例食管良性疾病患者(8.89±7.98)及48例體檢健康者(1.71±1.70)血清標本中的表達水平差異有統計學意義(F=13.42,P<0.001)，進一步進行組間兩兩比較結果表明，ESCC組血清miR-2861相對表達量與良性疾病組比較差異無統計學意義(t=5.677,P>0.05)，但食管癌組較健康人對照組明顯升高，差異有統計學意義(t=1.310,P<0.01)。

2.2血清miR-2861的表達與ESCC患者臨床病理參數的關系 以ESCC患者血清miR-2861相對表達量的中位數(5.23)為分界，將其分為高表達組(31例)和低表達組(18例)，分析兩組與ESCC患者臨床病理參數的關系。結果發現miR-2861的表達水平與年齡、性別、淋巴結轉移、神經侵犯、分化程度、腫瘤標志物升高均無顯著相關性(P>0.05)，但與分期、大小有關(P<0.01)。見表1。

表1 血清miR-2861的表達與ESCC患者臨床病理參數的關系

2.3miR-2861對ESCC的診斷效能評估 ROC曲線結果顯示，血清miR-2861診斷ESCC的ROC曲線下面積(AUCROC)為0.67(95%CI:0.58～0.76)，當cut-off值為1.584時，其敏感性為87.5%，特異性為49.41%。見圖1。

圖1 miR-2861對ESCC診斷的ROC曲線

3 討論

研究表明，miRNA在食管癌組織或細胞系中的表達譜與正常組織或細胞中的表達譜存在明顯差異，為食管癌診斷提供了重要的參考價值[7]。不同種類的miRNA在食管癌中的表達水平可能升高或者下降，有望成為食管癌診斷的生物學標志物。例如，miR-7在食管癌患者血清標本中呈低表達，并且其表達與淋巴結轉移和腫瘤大小有關，表明血清miR-7可能作為食管癌診斷的無創生物學標志物[8]。與之相反的是，Lin等[9]通過比較101例食管癌患者與97例健康人血漿中miR-34a的表達水平，結果發現食管癌患者血漿miR-34a的表達上調，并且在早期食管癌診斷中敏感性及特異性均較高。

本研究通過實時熒光定量PCR檢測證實了miR-2861在ESCC患者血清標本的表達水平明顯升高，其可能作為致癌基因在ESCC中發揮作用。此外，本研究還發現，miR-2861在ESCC組與食管良性疾病患者中的差異無統計學意義(P>0.05)，分析原因可能與納入的食管良性疾病患者數量較少有關。筆者通過分析miR-2861的表達與ESCC患者臨床病理參數之間的關系，發現miR-2861水平與分化程度和腫瘤大小明顯相關(P<0.05)。在診斷效能方面，Zheng等[10]通過ROC曲線評估miR-155在食管癌診斷中的臨床價值，結果發現其診斷食管癌的AUCROC為0.870，敏感性和特異性分別為83.5%和77.5%，是食管癌患者總生存期的1個獨立預測因子，并且可作為ESCC潛在的診斷標志物。本研究以食管良性疾病+體檢健康者為對照組，以ESCC為疾病組，采用ROC曲線評估其診斷ESCC的臨床效能，結果發現其敏感性為87.5%，特異性為49.41%，表明miR-2861有望作為ESCC潛在的新型診斷標志物。

本研究尚存在一些不足之處，例如由于實驗時間有限以及隨訪困難，目前尚未對食管癌患者進行跟蹤采血檢測miR-2861的變化水平，也并未在細胞水平檢測miR-2861的表達，并分析其生物學功能。下一步我們將擴大樣本量，收集患者隨訪資料分析預后信息，通過生物信息學方法預測并驗證miR-2861潛在的靶基因以及可能參與的信號通路，同時進行體外和體內實驗深入研究miR-2861在ESCC中的發病機制，為個性化治療提供依據。