重度腦外傷患者血清miR-146a水平與繼發性癲癇的相關性分析*

李雄飛，胡 偉，周明安，田少斌

湖北省天門市第一人民醫院神經外科，湖北天門 431700

腦外傷是常見的神經外科急癥，腦外傷患者主要臨床特征有認知功能、語言功能障礙。有研究發現，神經炎性反應是腦損傷的并發癥之一，神經炎癥治愈難，容易復發，最終導致患者神經功能受損[1-2]。繼發性癲癇是重度腦外傷常見的并發癥。癲癇是由于腦部神經元異常導致的中樞神經系統功能失常，癲癇反復發作會導致腦功能損傷。相關文獻顯示，微小RNA參與神經系統疾病和腦缺血所致神經損傷[3]；也有研究顯示，微小RNA在癲癇的發生中起重要作用[4]。微小RNA-146a(miR-146a)是一種調節Toll樣受體(TLRs)信號通路和炎癥因子受體信號通路的內源性調節因子，在炎癥性疾病中發揮重要作用[5]。但是目前鮮有文獻報道重度腦外傷患者中miR-146a與癲癇發病的關系。本文旨在研究重度腦外傷患者血清miR-146a水平與繼發性癲癇之間相關性，為早期干預和治療重度腦外傷繼發性癲癇提供新依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年1月至2020年2月本院收治的重度腦外傷住院患者104例為研究對象，其中男60例，女44例；年齡23～76歲，平均(38.92±15.86)歲。按照是否繼發癲癇分為重度腦外傷繼發性癲癇組61例，單一重度腦外傷組43例。納入標準：(1)重度腦外傷診斷標準參照《重型顱腦損傷救治指南》[6]；(2)癲癇的診斷依據2010年國際抗癲癇聯盟(ILAE)制定的癲癇發作和癲癇綜合征的分類方法[7]，結合臨床表現、腦電圖、頭顱MRI、家族史等診斷為原發性癲癇；(3)重度腦外傷后出現2次以上癲癇發作；(4)外傷前無癲癇病史，無家族遺傳史。排除標準：(1)有腦出血、腦梗死病史；(2)有腦血管畸形者；(3)患有自身免疫性疾病者；(4)有癲癇病史或家族遺傳癲癇者；(5)其他原因引起繼發性癲癇者；(6)臨床資料不全者。重度腦外傷繼發性癲癇患者腦外傷后24 h內出現癲癇11例，2周內發作35例，1個月內發作15例。選取同期本院體檢健康者70例為對照組，其中男40例，女30例；年齡22～78歲，平均(39.14±16.12)歲。重度腦外傷患者與對照組年齡、性別比較差異無統計學意義(P>0.05)。本研究征得所有受試者和其家屬同意，并簽署知情同意書；本研究通過本院倫理委員會批準。

1.2儀器與試劑 人腫瘤壞死因子-α(TNF-α)酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒、人白細胞介素-6(IL-6)ELISA試劑盒(北京博奧森生物技術有限公司，批號bsk11014、bs-0782R)；白細胞介素-1β(IL-1β)ELISA試劑盒(武漢默沙克生物公司，批號69-86579)；miRNA提取試劑盒(日本Takara公司，批號RA207004)；RNA SYBR Green PCR Kit熒光定量PCR試劑盒(上海康朗生物科技有限公司，批號KL101-969)；逆轉錄試劑盒(美國賽默飛世爾科技有限公司，批號Q6099)；Multiskan FC型全自動酶標儀(美國Thermo公司)；5427R型艾本德臺式高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)；SmartSpec Plus型核酸純度分析儀(美國伯樂公司)；CFX96型熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)。

1.3方法

1.3.1標本采集和處理 腦外傷患者入院24 h內、對照組入院體檢當天抽取研究對象靜脈血4 mL，裝入EP管中，室溫靜置35 min后，4 ℃、4 000 r/min離心10 min，收集上清液，分裝，保存于-80 ℃備用。

1.3.2實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測外周血miR-146a的表達 將樣品和試劑在常溫下復融，打開超凈工作臺滅菌30 min。在無菌超凈工作臺和冰盒上提取總RNA，用核酸純度分析儀測量A260 nm/A280 nm是否在1.8～2.0，并將提取的RNA分裝保存于-80 ℃備用。依據cDNA逆轉錄步驟，按照逆轉錄參數合成cDNA。采用qRT-PCR測定miR-146a水平，在避光環境下嚴格按照熒光定量PCR試劑盒操作步驟，利用qRT-PCR儀按照設定程序進行操作。程序設定參數為94 ℃預熱1 min，94 ℃ 25 s，60 ℃ 25 s，72 ℃ 20 s，共35個循環。總反應體系(20.0 μL)：SYBR Green mix 10.0 μL，上下游引物各2.0 μL，cDNA模板3.0 μL，ddH2O 3.0 μL。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，每例樣本重復操作3次，記錄Ct值，以U6為內參，采用2-ΔΔCt算法計算miR-146a相對表達量。引物見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.3TNF-α、IL-6、IL-1β水平檢測 采用TNF-α、IL-6、IL-1β ELISA試劑盒檢測所有受試者血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平。

2 結 果

2.13組受試者血清miR-146a水平比較 與對照組相比，重度腦外傷繼發性癲癇組、單一重度腦外傷組患者血清miR-146a水平較高(P<0.05)，與單一重度腦外傷組相比，重度腦外傷繼發性癲癇組患者血清miR-146a水平較高(P<0.05)。見表2。

表2 3組受試者血清miR-146a水平比較

2.23組受試者血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平比較 與對照組相比，重度腦外傷繼發性癲癇組、單一重度腦外傷組患者血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平較高(P<0.05)，與單一重度腦外傷組相比，重度腦外傷繼發性癲癇組患者血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平較高(P<0.05)。見表3。

表3 3組受試者血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平比較

2.3重度腦外傷繼發性癲癇患者血清miR-146a水平與血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平相關性分析 重度腦外傷繼發性癲癇患者血清miR-146a與TNF-α、IL-6、IL-1β水平呈正相關(r=0.580、0.505、0.474，P<0.05)。

2.4影響重度腦外傷繼發性癲癇多因素分析 以是否發生繼發性癲癇為因變量，以血清miR-146a、TNF-α、IL-6、IL-1β水平為自變量進行多因素Logistic回歸分析，結果顯示血清miR-146a、TNF-α、IL-6、IL-1β水平升高是重度腦外傷繼發性癲癇的危險因素(P<0.05)。見表4、表5。

表4 變量賦值

表5 影響重度腦外傷繼發性癲癇的多因素分析

3 討 論

繼發性癲癇是重度腦外傷后常見的嚴重并發癥，進一步加重了腦組織病理和神經損傷[8]。繼發性癲癇使重度腦外傷致殘率、病死率不斷上升。有研究顯示，癲癇發病過程與炎癥因子和神經系統炎癥相關[9]。神經系統炎癥在癲癇發作過程中發揮著重要作用，這與腦損傷有重要關系[10]。TNF-α、IL-6、IL-1β是與神經系統炎癥相關的細胞因子，在癲癇發作中發揮重要作用[11]。惲鴻博等[9]研究發現腦梗死繼發癲癇組和單一腦梗死組患者血清TNF-α、IL-1β水平明顯高于健康體檢組，腦梗死繼發癲癇組患者血清TNF-α、IL-1β水平明顯高于單一腦梗死組患者。本研究發現，與對照組相比，重度腦外傷繼發性癲癇組、單一重度腦外傷組患者血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平顯著較高，與單一重度腦外傷組相比，重度腦外傷繼發性癲癇組患者血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平明顯較高，提示炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β在繼發性癲癇發病過程中可能發揮重要作用。

近年來研究發現，微小RNA在癲癇疾病發病過程中具有重要作用[4]。miR-146a是第一個被發現的具有免疫調節作用的微小RNA，在炎性反應、細胞分化、免疫反應等生物學過程中發揮重要作用[12]。LV等[13]發現miR-146a能影響巨核細胞增殖、分化，可能通過TLR4信號通路調控血小板免疫炎性反應。DENG等[14]也發現miR-146a在人星形膠質細胞中水平呈上升趨勢，且miR-146a可通過抑制TLR4信號通路調節炎性細胞因子釋放。ORGANISTA-JUREZ等[15]發現顳葉癲癇患者大腦新皮層miR-146a水平顯著上調，且與癲癇發作頻率相關。ANSARI等[16]報告阿爾茨海默病患者的反應性星形膠質細胞中miR-146a水平顯著增加，miR-146a可能參與了大腦發育和神經變性。本研究發現，重度腦外傷繼發性癲癇組、單一重度腦外傷組患者血清miR-146a水平皆顯著高于對照組(P<0.05)，重度腦外傷繼發性癲癇組血清miR-146a水平顯著高于單一重度腦外傷組(P<0.05)，提示miR-146a可能參與重度腦外傷繼發性癲癇的發生。ZHANG等[17]研究發現癲癇大鼠腦組織中miRNA-146a水平顯著高于對照組，且與促炎細胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平變化相同，本研究進一步發現，miR-146a與IL-1β、IL-6和TNF-α呈正相關(P<0.05)，提示重度腦外傷患者miR-146a可能通過影響IL-1β、IL-6和TNF-α進一步影響繼發性癲癇發作。進一步分析發現miR-146a、TNF-α、IL-6、IL-1β水平升高是影響繼發性癲癇的危險因素，提示檢測血清miR-146a水平可為臨床診斷繼發性癲癇的發生提供參考依據。

綜上所述，重度腦外傷繼發性癲癇患者血清miR-146a水平上調，miR-146a是影響繼發性癲癇的危險因素，監測重度腦外傷患者血清miR-146a有助于診斷繼發性癲癇的發生。本研究由于樣本數量有限，研究結果具有一定的局限性。本課題組將進一步增加樣本量探討重度腦外傷患者血清miR-146a與繼發性癲癇的關系。