LINC00261和miR-522-3p在結直腸癌中的表達及其與患者預后的關系

賴志亨，鄒 江

海南省中醫院肛腸科，海南海口 570203

結直腸癌是全球發病率僅次于肺癌和乳腺癌的第三大癌癥，其病死率僅次于肺癌，每年導致約60萬例腫瘤相關病例死亡[1]。雖然結直腸癌的治療有效率在不斷提高，但是患者的生存率和生存質量仍然不盡如人意，因此急需研究新的治療方法[2]。結直腸癌是一種復雜的多基因疾病，其具體的發病機制尚未完全明確。長鏈非編碼RNA(lncRNA)在腫瘤發生和發展的過程中起著至關重要的作用，許多研究已經證實lncRNA異常表達是結直腸癌發病的重要調控機制之一[3-4]。LINC00261是腫瘤相關lncRNA之一，在非小細胞肺癌和肝細胞肝癌等腫瘤中發揮抑癌因子的作用[5-6]。lncRNA通常作為競爭性內源RNA(ceRNA)結合微小RNA(miRNA)發揮作用[7]。在非小細胞肺癌中LINC00261通過與微小RNA-522-3p(miR-522-3p)直接結合發揮抑癌作用[8]。miR-522-3p是新近發現的miRNA，其可有效促進骨肉瘤細胞的生長[9]。目前LINC00261、miR-522-3p與結直腸癌關系的研究較少，二者在結直腸癌中是否具有調控作用尚不清楚。本研究旨在探討LINC00261和miR-522-3p在結直腸癌中的表達及相關性，并分析了二者與患者預后的關系，現將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2013年1月至2014年12月在本院行手術治療的結直腸癌患者為研究對象。共納入結直腸癌組織標本68例和其配對的癌旁組織標本68例。患者年齡36～75歲，平均(65.51±8.38)歲；男42例，女26例；部位：結腸38例，直腸30例；腫瘤最大徑：≤5 cm 50例，>5 cm 18例；浸潤深度：T1 33例，T2 21例，T3 10例，T4 4例；分化程度：高分化30例，中分化26例，低分化12例；臨床分期：Ⅰ期27例，Ⅱ期21例，Ⅲ期20例；淋巴結轉移：無21例，有47例。本研究經本院倫理委員會審核通過，患者及家屬均簽署知情同意書。納入標準：(1)患者均初次進行手術治療，且未接受過其他任何形式的抗腫瘤治療；(2)均獲得手術切除組織，并經病理專家證實為結直腸癌組織和癌旁組織；(3)具有完整的臨床病理資料和隨訪資料。排除標準：(1)發生遠處器官轉移；(2)合并有其他類型的腫瘤；(3)合并有嚴重器質性疾病者。

1.2儀器與試劑 Trizol試劑購自北京天漠科技開發有限公司，氯仿、異丙醇和無水乙醇購自天津風船化工有限公司；DEPC水購自上海生工有限公司；Nanodrop2000購自美國Thermo公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit逆轉錄試劑盒和SYBR Premix Ex TaqTMⅡPCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；LINC00261、miR-522-3p和內參U6引物由美國Invitrogen有限公司合成。7500實時熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司。

1.3方法

1.3.1實時熒光定量PCR 手術切除的結直腸癌組織和癌旁組織立即凍于液氮中，采用研缽將其研磨后加入Trizol試劑1 mL裂解，移至EP管后加入氯仿200 μL混勻靜置5 min，4 ℃高速離心30 min，吸取最上層水相層溶液450 μL與等體積的異丙醇混勻后4 ℃高速離心30 min，可見EP管底部白色沉淀為RNA，無水乙醇洗滌兩次，加入DEPC水溶解RNA，測得RNA純度(A260 nm/A280 nm為1.8～2.0時，純度較高)和濃度。按照逆轉錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit說明書配制逆轉錄反應體系：5×PrimeScript Buffer 24 μL，PrimeScript RT Enzyme mix Ⅰ 1 μL，Oligo dT primer 1 μL，Random 6 mers 1 μL，總RNA 0.5 μg，RNase Free H2O補足20 μL，37 ℃ 15 min，85 ℃ 30 s將總RNA逆轉為cDNA。

以cDNA為模板，按照SYBR Premix Ex TaqTMⅡ PCR試劑盒說明書配制qRT-PCR反應體系，cDNA模板2 μL、ddH2O 2 μL、引物F 0.4 μL、引物R 0.4 μL、ROX Reference Dye 0.2 μL，SYBR Premix EX TaqTMⅡ 5 μL，總體積10 μL。擴增反應條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個循環。7500實時熒光定量PCR儀上機檢測各樣品的循環閾值(Ct)。采用2-ΔΔCt公式以U6基因為內參，計算LINC00261和miR-522-3p的相對表達量。LINC00261引物F：5′-ACA TTT GGT AGC CCG TGG AG-3′；R：5′-TCT TCC CCG GAG AAC TAG CA-3′。miR-522-3p引物F：5′-GGG CTC TAG AGG GAA GCG C-3′；R：5′-CAG TGC GTG TCG TGG AGT-3′。內參U6引物F：5′-CTT CGG CAG CAC ATA TAC T-3′；R：5′-AAA ATA TGG AAC GCT TCA CG-3′。

1.3.2隨訪方法 患者術后采用電話詢問或者門診查詢的方式每隔3個月隨訪1次，直至患者死亡或者完成5年隨訪時間時截止。

2 結 果

2.1LINC00261和miR-522-3p在結直腸癌組織中的表達水平 LINC00261在結直腸癌組織中的表達水平低于其在癌旁組織中的表達水平(P<0.05)，miR-522-3p在結直腸癌組織中的表達水平高于其在癌旁組織中的表達水平(P<0.05)，見表1。

表1 LINC00261和miR-522-3p在結直腸癌組織及癌旁組織中的表達水平

2.2結直腸癌組織中LINC00261、miR-522-3p表達水平與患者臨床病理參數之間的關系 LINC00261在結直腸癌組織中的表達水平與患者的性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤最大徑和浸潤深度均無關(P>0.05)，與分化程度、臨床分期和淋巴結轉移情況相關(P<0.05)。miR-522-3p在結直腸癌組織中的表達水平與性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤最大徑、浸潤深度和分化程度均無關(P>0.05)，與臨床分期和淋巴結轉移情況相關(P<0.05)。見表2。

表2 LINC00261和miR-522-3p在結直腸癌組織中的表達水平與臨床病理參數之間的關系

2.3結直腸癌組織中LINC00261、miR-522-3p表達水平對患者預后的影響 對68例結直腸癌患者進行隨訪，其中35例死亡，33例存活，5年生存率為48.53%。

根據LINC00261在結直腸癌組織中的表達水平分為LINC00261高表達組(>0.64，32例)和LINC00261低表達組(≤0.64，36例)。LINC00261高表達組的5年生存率為65.63%(21/32)，LINC00261低表達組的5年生存率為33.33%(12/36)。繪制Kaplan-Meier生存曲線，Log Rank檢驗分析顯示LINC00261低表達組的預后比LINC00261高表達組預后更差(χ2=5.762，P=0.021)。

根據miR-522-3p在結直腸癌組織中的表達水平分為miR-522-3p高表達組(>1.79，33例)和miR-522-3p低表達組(≤1.79，35例)。miR-522-3p高表達組的5年生存率為36.36%(12/33)，miR-522-3p低表達組的5年生存率為60.00%(21/35)。繪制Kaplan-Meier生存曲線，Log Rank檢驗分析顯示miR-522-3p高表達組的預后比miR-522-3p低表達組的預后更差(χ2=8.710，P=0.016)。

2.4多因素Cox回歸分析結直腸癌患者預后不良因素 建立Cox比例風險回歸模型，以本研究資料為樣本，以直腸癌患者預后狀況為應變量，賦值1=死亡，0=生存，t=生存期。經臨床和統計專家討論決定，以LINC00261和miR-522-3p表達及表2中P<0.10的指標/因素為自變量。此外，為提高統計效率并使回歸結果清晰，將原為連續數值的LINC00261和miR-522-3p表達指標，按其均值進行分段(分層)，轉化成高和低表達的兩分類變量。各變量賦值如下：分化程度中，1為低分化，0為中高分化；臨床分期中，1為Ⅲ期，0為Ⅰ+Ⅱ期；淋巴結轉移中，1為有，0為無；LINC00261表達中，1為LINC00261表達水平<0.64，0為LINC00261表達水平≥0.64；miR-522-3p表達中，1為miR-522-3p表達水平>1.79，0為miR-522-3p表達水平≤1.79。回歸過程采用逐步后退法，以進行自變量的選擇和剔除，設定α剔除=0.10，α入選=0.05。多因素Cox回歸結果顯示，高臨床分期、低分化程度、淋巴結轉移、LINC00261低表達和miR-522-3p高表達是結直腸癌患者預后不良的獨立危險因素(P<0.05，HR>1)，見表3。

表3 多因素Cox回歸分析結直腸癌患者預后不良的獨立危險因素

2.5LINC00261和miR-522-3p在結直腸癌組織中表達的相關性 Pearson相關分析顯示，LINC00261與miR-522-3p在結直腸癌組織中的表達水平呈負相關(r=-0.422，P<0.001)。

3 討 論

結直腸癌是最常見的消化系統惡性腫瘤之一，發病率和病死率均較高，隨著飲食習慣的改變和生活壓力的增加，結直腸癌的發病率呈上升趨勢[10]。手術是結直腸癌最有效的治療方法，主要針對結直腸癌早期患者，約90%的結直腸癌早期患者可以通過手術治愈，患者的5年生存率約為90%[11]。但是結直腸癌的早期癥狀不明顯，大多數患者確診時已經處于中晚期，出現病灶轉移，治療方式為手術切除原發病灶和轉移病灶，輔助化學治療和放射治療，但治療效果不佳，晚期結直腸癌患者5年生存率僅10%[2]。通過靶向治療與結直腸癌進展相關的關鍵分子，可以改善結直腸癌患者的預后，瑞戈非尼、阿帕替尼、呋喹替尼及安羅替尼等小分子靶向藥物已經在晚期結直腸癌治療中取得了較好的療效[12]，但是存在耐藥現象，仍然達不到理想的療效，因此研究結直腸癌發生發展過程中的關鍵分子，探討結直腸癌新的治療靶點具有重要的臨床意義。

lncRNA是長度超過200個核苷酸的RNA，參與細胞凋亡、細胞分化、腫瘤發生和轉移的調控[13]。lncRNA可充當癌基因和抑癌基因，在腫瘤生長中發揮關鍵作用，并可以作為調控腫瘤進展的分子靶點[14]。LINC00261可在結直腸癌中發揮抑癌作用，ZHOU等[15]采用原位雜交發現，LINC00261在結腸癌組織中表達的陰性率高于其附近非癌組織，并與結腸癌患者的臨床分期相關，LINC00261表達水平降低是影響結腸癌患者術后無復發生存時間的獨立危險因素。本研究結果發現，與癌旁組織相比，LINC00261在結直腸癌組織中表達水平降低，LINC00261的表達水平與分化程度、臨床分期和淋巴結轉移相關，與ZHOU等[15]的報道基本一致，這提示LINC00261可能參與了結直腸癌的進展。另一方面，LINC00261低表達組的預后較差，LINC00261低表達是結直腸癌患者預后不良的獨立危險因素，這表明LINC00261可作為預后判斷的分子標志物。

miR-522-3p在慢性炎癥中首次被報道[16]，目前的研究較少，炎癥與結直腸癌的發生發展密切相關，但其能否通過調節炎癥反應參與結直腸癌的進展尚不清楚。本研究發現，與癌旁組織相比，miR-522-3p在結直腸癌組織中表達增加，其表達水平與臨床分期和淋巴結轉移情況相關，且miR-522-3p高表達的結直腸癌患者的預后較差，miR-522-3p高表達是患者預后不良的獨立危險因素。這表明miR-522-3p可能參與結直腸癌的惡性進展，是患者預后不良的分子標志物。SHUAI等[17]報道在結直腸癌組織和細胞系中miR-522-3p的表達增加，miR-522-3p過表達促進細胞增殖，降低細胞凋亡率，發揮促癌基因的作用。CHEN等[9]研究發現，miR-522-3p在骨肉瘤中亦呈異常高表達狀態，且miR-522-3p高表達的患者的預后較差。

miRNA是lncRNA重要調控機制之一，且一個lncRNA可靶向調控多個miRNA，YAN等[18]報道LINC00261在結腸癌細胞中表達水平降低，過表達LINC00261可靶向調節miR-324-3p的表達抑制結腸癌細胞的增殖和遷移、侵襲能力，促進細胞凋亡，進而影響結腸癌的進展。此外，在非小細胞肺癌中LINC00261通過調節miR-522-3p抑制腫瘤的發生發展[8]，而LINC00261是否調控miR-522-3p的表達參與結直腸癌的疾病進展尚不清楚。本研究采用Pearson相關分析發現，LINC00261和miR-522-3p在結直腸癌組織中表達水平呈負相關，lncRNA可競爭性抑制miRNA，因此推測LINC00261可能是通過抑制miR-522-3p在結直腸癌組織中發揮作用，但是具體的作用機制將在后續的細胞水平中進行研究。

綜上所述，結直腸癌組織中LINC00261低表達，miR-522-3p高表達。LINC00261和miR-522-3p均與結直腸癌患者不良病理參數和預后相關，兩者在結直腸癌組織中表達水平呈負相關。LINC00261和miR-522-3p是結直腸癌患者潛在的預后標志物和治療靶標。