槲皮素對痛風模型大鼠血清NETs和淋巴細胞水平的影響*

鐵 寧，李 剛，白麗杰，王 靜，趙 靜，王 勇△

1.內蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院風濕免疫科，內蒙古呼和浩特 010059；2.內蒙古醫(yī)科大學藥學院，內蒙古呼和浩特 010059

痛風是一種常見的關節(jié)炎，男性發(fā)病率高于女性，且各年齡段均可能出現痛風[1]。痛風常在夜間發(fā)作，受累關節(jié)疼痛進行性加劇，呈撕裂樣、刀割樣或咬噬樣，難以忍受。關節(jié)可表現為紅腫灼熱、皮膚緊繃、觸痛明顯、功能受限，疼痛感持續(xù)幾天至幾周不等，緩慢減輕至消失[2]。發(fā)病關節(jié)會導致活動及功能受限，影響日常生活，因此，對痛風的發(fā)生、發(fā)展機制進行深入研究，并探討藥物治療的臨床療效和藥理作用機制，具有十分重要的意義[3]。有研究指出，在痛風急性發(fā)作期患者關節(jié)腔內多出現單鈉尿酸鹽晶體沉積，誘導多形核中性粒細胞聚集，且當炎癥反應加重后，產生大量活性氧，誘導中性粒細胞胞外誘捕網(NETs)形成，降解趨化因子及細胞因子，抑制炎癥反應，有助于急性痛風性關節(jié)炎的恢復[4-5]。槲皮素又名櫟精，在槐樹、蘋果、茶樹、銀杏、西紅柿、丹皮等植物中廣泛存在，具有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、抗菌、祛痰止咳、免疫調節(jié)、神經保護及抗血栓等藥理作用[6-7]。近年來，有關槲皮素對血清NETs和淋巴細胞水平影響的報道較少。因此，本研究擬構建痛風動物模型，分析槲皮素對痛風動物模型血清NETs和淋巴細胞水平的影響。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究所使用的30只6周齡Wistar雄性大鼠均購自南京青龍山實驗動物繁育場，體質量180～210 g，平均(190.32±13.29)g。常規(guī)適應性飼養(yǎng)1周，5只1籠，分籠飼養(yǎng)，維持室溫22～26 ℃，濕度55%～65%，正常晝夜循環(huán)，維持12 h光照，大鼠灌胃、換水、添加飼料等均由專人進行。

1.2方法 將所有大鼠依照體質量編號，并采用隨機數表法分為3組，即對照組、模型組、槲皮素組，每組10只。模型組和槲皮素組進行造模，取仰臥位在解剖板上固定，右后肢小腿踝關節(jié)進行常規(guī)消毒，選取踝關節(jié)外側作為6號注射針穿刺點，針口和脛骨為45°夾角傾向上刺入踝關節(jié)腔內，注射250 mg/mL尿酸鈉溶液0.2 mL，踝關節(jié)對側鼓起則注射成功。對照組注入等體積的生理鹽水。造模成功后槲皮素組大鼠每天早上9：00給予200 mg/kg的槲皮素灌胃，持續(xù)給藥1周，對照組及模型組同期灌胃等體積的蒸餾水。

1.3觀察指標 給藥前和第7天給藥后依照炎癥指數評定準則[8]和Goderre功能障礙指數[9]對大鼠急性炎癥狀況進行評估，使用足容積測量儀檢測足趾腫脹度，炎癥指數分級如下：0級，正常；1級，左后足皮膚有紅斑、關節(jié)稍微腫脹；2級：左后足顯著紅腫，關節(jié)部位骨性標志消失；3級：左后足關節(jié)肢體發(fā)生腫脹。Goderre功能障礙指數分級如下：0級，步態(tài)正常，四足著地均勻；1級，輕微跛行，左后足足趾未展開，著地減輕；2級，跛行顯著，左后足趾背著地、屈起；3級：三足步態(tài)，左后足完全離地。給藥第1天和第6天眼底取血，離心收集血清，使用全自動生化分析儀分析血清中淋巴細胞水平，后取100 μL血清加入100 μL PicoGreen熒光染料，避光孵育300 s，使用熒光染色法檢測血清中游離DNA/中性粒細胞胞外誘捕網(cf-DNA/NETs)水平，采用熒光酶標儀檢測熒光值，后繪制標準曲線計算cf-DNA/NETs水平。

2 結 果

2.1模型組、槲皮素組大鼠功能障礙指數、炎癥指數和足趾腫脹度的比較 本研究結果顯示，采用槲皮素干預前模型組和槲皮素組大鼠功能障礙指數、炎癥指數和足趾腫脹度差異無統計學意義(P>0.05)；給藥后，槲皮素組大鼠功能障礙指數、炎癥指數和足趾腫脹度均明顯低于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 模型組和槲皮素組大鼠功能障礙指數、炎癥指數和足趾腫脹度的比較

2.23組大鼠血清中淋巴細胞水平的比較 本研究結果顯示，給藥前，槲皮素組和模型組大鼠血清中淋巴細胞水平差異無統計學意義(P>0.05)，但模型組和槲皮素組大鼠血清中淋巴細胞水平均明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；進一步分析發(fā)現，給藥后3組大鼠血清中淋巴細胞水平差異有統計學意義(P<0.05)，其中模型組最高，對照組最低，且兩兩比較差異均有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 3組大鼠血清中淋巴細胞水平檢測結果比較

2.33組大鼠血清中cf-DNA/NETs水平的比較 本研究結果顯示，給藥前，槲皮素組和模型組大鼠血清中cf-DNA/NETs水平差異無統計學意義(P>0.05)，但模型組和槲皮素組大鼠血清中cf-DNA/NETs水平均明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；進一步分析發(fā)現，給藥后3組大鼠血清中cf-DNA/NETs水平差異有統計學意義(P<0.05)，其中模型組最高，對照組最低，且兩兩比較差異均有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 3組大鼠血清中cf-DNA/NETs水平的比較

3 討 論

槲皮素分布廣泛，屬于黃酮醇類化合物，具有多種生物活性。有研究指出，槲皮素具有對抗自由基作用，可捕獲自由基預防脂質過氧化反應，抑制腫瘤，并還具有較強的抗炎、抗菌、預防糖尿病、抗過敏等較強的生物活性[10]。此外，槲皮素還具有輔助治療高血壓及冠心病的作用，且槲皮素毒性低，具有較大研究價值。有學者指出，采用槲皮素對痛風性關節(jié)炎模型大鼠進行干預后，具有顯著的抗氧化、抗炎活性，但其作用機制尚不清楚[11]。有研究指出，將尿酸鈉晶體注入大鼠關節(jié)腔內可用于建立急性痛風性關節(jié)炎病變模型，其臨床表現與病理表現相似[12]。采用該方案造模后關節(jié)腔內出現中性粒細胞，在滑膜和關節(jié)積液中，細胞吞噬尿酸單鈉結晶，擴大炎性反應和釋放趨化介質，同時關節(jié)滑膜肥厚和增生，關節(jié)液量增加。該造模方案快速、操作簡單、成功率高，被視為經典的急性痛風性關節(jié)炎造模方法，因此，本研究采用該方案進行造模。

痛風為慢性且復雜的炎癥反應，與機體免疫系統密切相關，其中天然免疫和適應性免疫在機體持續(xù)炎癥階段起到十分重要的主導作用。有研究指出，痛風發(fā)病初期，天然免疫激活單核細胞進入炎癥組織，將尿酸鈉晶體吞噬，促進淋巴細胞聚集，合成并分泌大量白細胞介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α等炎癥因子[13]。本研究結果顯示，槲皮素干預7 d后，槲皮素組大鼠功能障礙、炎癥指數和足趾腫脹度均明顯低于模型組，且槲皮素組大鼠體內淋巴細胞水平顯著降低。說明槲皮素能夠顯著減輕痛風模型大鼠的關節(jié)腔內炎性反應，減少關節(jié)液容積。

人體天然免疫系統中的中性粒細胞是重要的效應細胞，在早期免疫應答階段起到十分重要的作用。有學者研究發(fā)現，中性粒細胞活化后會釋放由組蛋白和DNA構成的網狀結構，該結構被稱為NETs[14]。此外，NETs為球狀顆粒串并相互纏繞形成網狀陷阱樣結構，可限制多種病原微生物擴散，捕獲病原微生物，是中性粒細胞殺菌的新途徑。但過量NETs可誘導凝血功能障礙、內皮細胞損傷、炎癥反應，對機體產生有害作用。本研究結果顯示，模型組和槲皮素組大鼠血清中cf-DNA/NETs水平均明顯高于對照組，給藥后槲皮素組大鼠血清中cf-DNA/NETs明顯降低，且槲皮素組大鼠血清中cf-DNA/NETs低于模型組。說明采用槲皮素對痛風模型大鼠干預后可有效降低血中cf-DNA/NETs水平，進而有效下調體內炎癥反應程度[15]。

綜上所述，槲皮素干預痛風模型大鼠后可有效降低血清NETs和淋巴細胞水平。但本研究并未對基因水平的改變進行分析，有待進一步探討。