篦子三尖杉內(nèi)生真菌的分離鑒定和抑菌活性分析

韓潔 桂艷玲 付強(qiáng) 鄒頡 趙杰宏

摘 要：珍稀瀕危藥用植物篦子三尖杉（Cephalotaxus oliveri Mast）是臨床白血病藥物三尖杉酯堿和高三尖杉酯堿的重要來源，因此，篦子三尖杉的內(nèi)生真菌具有潛在的藥用價(jià)值。通過從篦子三尖杉中分離純化，篩選出16株外觀差異較大的菌株，其中4株無產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)。經(jīng)顯微結(jié)構(gòu)和ITS分子鑒定，發(fā)現(xiàn)其中11株屬于鏈格孢屬。抑菌試驗(yàn)表明，10號(hào)菌株對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用較大，11號(hào)對(duì)白葡萄球菌的抑制作用較大;11號(hào)和12號(hào)對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制作用較大;7號(hào)對(duì)大腸桿菌的抑制作用較大;有5株真菌的抑菌譜較廣。篩選的內(nèi)生真菌具有藥用活性，為進(jìn)一步篩選有藥用價(jià)值的內(nèi)生真菌及其代謝產(chǎn)物奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：篦子三尖杉;內(nèi)生真菌;ITS;抑菌活性

Abstract：The rare and endangered medicinal plant Cephalotaxus oliveri Mast is an important source of Harringtonine and Homoharringtonine for clinical leukemic therapy，so that the endophytic fungi of C.oliveri have somewhat potential medicinal value.Here，there were sixteen strains with different appearance screened out by isolation and purification from the leaves and branches of C.oliveri.Among them，there were four strains without sporulation structure，and eleven strains identified as Alternaria by microscopic morphology and ITS identification.The results of bacteriostatic experiment showed that the No.10 strain had greater inhibitory effects on Staphylococcus aureus.The same inhibitory effects were also found for No.11 strain on Staphylococcus albus，the No.11 stain and the No.12 strain on Bacillus subtilis，and the No.7 strain on Escherichia coli.Among which，there were five strains with a wide spectrum of bacteriostatic activity.It provides basis for further screening endophytic fungi for medicinal use.

Keywords：Cephalotaxus oliveri; Endophytic fungi; Internal transcribed spacer; Antimicrobial activity

珍稀瀕危藥用植物篦子三尖杉隸屬于三尖杉科（Cephalotaxaceae）三尖杉屬（Cephalotaxus），為國家二級(jí)保護(hù)植物，喜溫暖濕潤的生態(tài)環(huán)境，多分布在貴州、云南、四川等地海拔300～1500 m的山林中[1]。篦子三尖杉的枝葉含有多種生物堿，其中三尖杉酯堿和高三尖杉酯堿可以有效地治療急性非淋巴細(xì)胞白血病[2]。隨著人們的濫砍亂伐和保護(hù)不力，資源短缺等問題持續(xù)出現(xiàn)。生活在植物根、莖、葉等器官中的內(nèi)生真菌，在與宿主植物長期“協(xié)同進(jìn)化”過程中，有的內(nèi)生真菌也具有了生成類似宿主活性物質(zhì)的能力，如紫杉醇[3]、細(xì)胞松弛素[4]、鬼臼毒素[5]、長春新堿[6]、喜樹堿[7]等。通過對(duì)篦子三尖杉內(nèi)生真菌開展分離純化、顯微和分子鑒定，以及抑菌活性分析，篩選出有廣譜抑菌活性的內(nèi)生真菌，為深入研究和開發(fā)具有藥用價(jià)值的內(nèi)生菌株奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

篦子三尖杉（Cephalotaxus oliveri Mast）采自四川筠連。通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTFATrGATATGC-3′）（自上海生工合成）、DNA 提取試劑盒（天根生物）、DNA聚合酶（大連寶生物）。 大腸桿菌（Escherichia coli），枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），白葡萄球菌（Staphylococcus albus）由貴州中醫(yī)藥大學(xué)微生物研究室提供。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)生真菌的分離和觀察

采集篦子三尖杉的健壯枝葉，流水沖洗干凈后用75%乙醇和次氯酸鈉溶液（含7%有效氯） 各浸泡10 min，隨后在無菌水中多次清洗干凈，再把該枝葉用滅菌手術(shù)刀切割成1 cm左右的節(jié)段，放在PDA培養(yǎng)基中，放人工培養(yǎng)箱中在28 ℃培養(yǎng)，同時(shí)將最后一次沖洗葉片和莖段的滅菌水接種在PDA培養(yǎng)基中，同樣條件下培養(yǎng)作為空白對(duì)照。培養(yǎng)一周后，分離真菌菌落轉(zhuǎn)移到新鮮的PDA培養(yǎng)基中進(jìn)行純化培養(yǎng)。純化的單菌落培養(yǎng)7 d后，取培養(yǎng)皿觀察菌落正反面的形態(tài)特征，然后剪取透明膠帶粘取菌落中間旺盛生長菌絲于載玻片上，直接顯微觀察，或者滴加乳酸溴酚棉蘭染色液，染色2～3 min后在顯微下觀察產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)或菌絲結(jié)構(gòu)，并進(jìn)行真菌鑒定。

1.2.2 提取DNA擴(kuò)增ITS序列

刮取菌絲100 mg放于兩支離心管中，在液氮中速凍后研磨成細(xì)粉，用DNA 提取試劑盒按照操作說明書提取DNA。取1 μL DNA做模板，加入通用引物ITS1、ITS4各1 μL，再往其中加入 2×Taq PCR Mix 12.5 μL，最后補(bǔ)加ddH2O至25 μL，在PCR儀中進(jìn)行常規(guī)擴(kuò)增反應(yīng)[8-9]。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測后，送上海生工測序。

1.2.3 序列比對(duì)和聚類分析

獲得的ITS序列在NCBI進(jìn)行 Blastn（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/）比對(duì)，選取相似性最高的菌種作為分子鑒定的結(jié)果。在MEGA 7.0中，將獲得的不同ITS序列進(jìn)行Align對(duì)齊，截去兩端不齊序列后，選擇Phylogenetic Analysis，點(diǎn)擊Phylogeny，選擇Construct/Test Neighbor-Joining Tree，更改No.of Bootstrap Replications為1000，在所有參數(shù)值都默認(rèn)時(shí)點(diǎn)擊Compute，最后查看和下載聚類樹。

1.2.4 內(nèi)生真菌代謝物抑菌活性分析

將液體PDA培養(yǎng)的菌體用紗布過濾，擠出多余水分，并用濾紙吸干，然后在研缽中液氮速凍，快速研磨成粉，稱取2 g粉末裝入廣口瓶中，加入10 mL乙酸乙酯攪拌均勻，靜置待用。無粉末的乙酸乙酯作為空白對(duì)照。用孔徑6 mm打孔器打出濾紙圓片，滅菌后放入提取液中。取四種細(xì)菌的水懸液，調(diào)OD600為0.7左右，快速倒入不燙手暫未凝固的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，快速搖勻后迅速倒入培養(yǎng)皿中，凝固后獲得細(xì)菌測試菌培養(yǎng)基，培養(yǎng)細(xì)菌1 d后，將提取液飽和的濾紙片接種到培養(yǎng)皿中，各三個(gè)重復(fù)，培養(yǎng)7 d后觀察和比較抑菌圈大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生真菌的形態(tài)特征

經(jīng)過分離和培養(yǎng)，空白對(duì)照未發(fā)現(xiàn)污染，說明分離的菌株來自內(nèi)生真菌，共獲得了110個(gè)內(nèi)生真菌菌落。根據(jù)菌落的外觀形態(tài)差異，篩選出16種有明顯差異的內(nèi)生菌株。除了1號(hào)、3號(hào)、13號(hào)、15號(hào)無產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)外，其余編號(hào)菌株皆有產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)，可以進(jìn)行初步判斷，多數(shù)屬于鏈格孢屬真菌，分生孢子具有典型的壁磚狀結(jié)構(gòu)，孢子表面具橫隔和縱隔，橫隔較粗（圖1）。

2.2 抑菌活性分析

不同內(nèi)生真菌對(duì)不同細(xì)菌的抑菌活性不同，除了1號(hào)，1、3號(hào)真菌對(duì)四種細(xì)菌都沒有明顯抑菌圈外，其他真菌至少對(duì)1種細(xì)菌有抑制作用。對(duì)金黃色葡萄球菌有抑制作用的內(nèi)生真菌是2號(hào)、5號(hào)、8號(hào)、9號(hào)、10號(hào)，其中10號(hào)抑菌圈較大。對(duì)白葡萄球菌有抑制作用的是2號(hào)、5號(hào)、7號(hào)、8號(hào)、9號(hào)、10號(hào)、11號(hào)，其中11號(hào)抑菌圈較大;對(duì)枯草芽孢桿菌有抑制作用的是2號(hào)、4號(hào)、5號(hào)、8號(hào)、9號(hào)、10號(hào)、11號(hào)、12號(hào)、14號(hào)，其中11號(hào)和12號(hào)抑菌圈較大;對(duì)大腸桿菌有抑制作用的是7號(hào)、10號(hào)，其中7號(hào)抑菌圈較大（圖2）。可以看出，2號(hào)、5號(hào)和10號(hào)的抑菌譜較廣和抑菌活性較強(qiáng)。

2.3 內(nèi)生真菌ITS分子鑒定

將PCR擴(kuò)增的ITS產(chǎn)物電泳后得到600 bp左右的序列條帶。將ITS序列在NCBI blastn比對(duì)進(jìn)行分子鑒定，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和ITS聚類分析（圖3），結(jié)果顯示16株菌株的種群結(jié)構(gòu)多樣性較小，16株內(nèi)生真菌中有11株為Alternaria（鏈格孢屬），其余5株分別為Diaporthe（腐皮殼屬）、Fusarium（鐮刀菌屬）、Phyllosticta（葉點(diǎn)霉屬）、Pestalotiopsis（擬盤多毛孢屬）、Bjerkandera（黑管菌屬）。

3 結(jié)論與討論

通過從篦子三尖杉枝葉中分離純化，篩選出16株形態(tài)各異的內(nèi)生真菌菌株，經(jīng)顯微特征和ITS分子鑒定，發(fā)現(xiàn)其中1號(hào)、3號(hào)、13號(hào)和15號(hào)無產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)，分別屬于黑管菌（Bjerkandera）、腐皮殼菌（Diaporthe）、葉點(diǎn)霉（Phyllosticta）和擬盤多毛孢（Pestalotiopsis），另外4號(hào)為鐮刀菌（Fusarium），剩余的11株均有產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)，均屬于鏈格孢（Alternaria），可見這16個(gè)菌株的種群多樣性較小，優(yōu)勢菌種為鏈格孢屬真菌，與葉靜等[10]、劉兆迪等[11]報(bào)道的優(yōu)勢菌株和活性菌株有所不同，可能與材料來源、篩選方法、樣品數(shù)量等有關(guān)。抑菌試驗(yàn)表明，5株非鏈格孢菌中，只有4號(hào)對(duì)枯草芽孢桿菌有抑菌活性，其余皆無抑菌活性。抑菌活性主要體現(xiàn)在鏈格孢菌，其中2號(hào)、5號(hào)和10號(hào)的抑菌譜較廣，而且對(duì)致病性金黃色葡萄球菌有一定的抑菌活性。可見，個(gè)別菌株具有較好的藥用潛力。這些內(nèi)生真菌是否通過“協(xié)同進(jìn)化”也獲得生產(chǎn)三尖杉酯堿或高三尖杉酯堿的能力，尚需深入分析。

參 考 文 獻(xiàn)：

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