CYP2C19基因多態性檢測的臨床實驗室性能驗證*

李婧，李林靜，劉轉，楊文娟，馬青梅，張安安，楊海棠，劉澤菁，劉欣躍(蘭州大學第二醫院檢驗醫學中心，蘭州 730030)

人細胞色素P450酶等位基因(CYP2C19)編碼的S-美芬妥英羥化酶參與了一系列臨床常用藥物代謝，其中最常見的就是氯吡格雷抵抗[1]。阿司匹林聯合一種P2Y12受體抑制劑(氯吡格雷、替格瑞洛和普拉格雷)的雙聯抗血小板治療，是預防直接經皮冠狀動脈介入治療(percutaneous coronary intervention, PCI)術后支架內血栓等再次發生血栓事件的基石[2]。荷蘭一項歷時8年的POPular Genetics研究——氯吡格雷基因檢測相關臨床隨機對照試驗(RCT)證實，在PCI術后的ST段抬高性心肌梗死(STEMI)患者中，以CYP2C19基因型指導P2Y12受體抑制劑的個體化抗血小板降階治療策略，對于預防1年內血栓事件的療效不劣于替格瑞洛或普拉格雷的強效標準治療，而且出血發生率更低[3]。因此，本研究擬根據臨床需求及ISO15189實驗室質量管理體系的要求[4]，進行人類CYP2C19基因多態性檢測試劑盒(熒光PCR法)性能驗證。

1 資料與方法

1.1研究對象 納入2018年1月至10月蘭州大學第二醫院計劃進行PCI手術且尚未應用任何抗血小板治療藥物的急性心肌梗死患者20例，其中男17例、女3例，年齡(59.6±8.6)歲，所有患者均無家族遺傳史，無血緣關系。本研究通過蘭州大學第二醫院倫理委員會審核批準(No.2018A-065)。

1.2儀器與試劑 7500實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)，Qubit3.0核酸定量儀(美國Life Technologies公司)。人CYP2C19基因多態性檢測試劑盒(熒光PCR法)及核酸提取試劑盒(蘇州曠遠生物分子技術公司)，氯化血紅素、膽紅素及膽固醇(北京索萊寶科技公司)。

1.3方法

1.3.1外周血DNA提取 采集急性心肌梗死患者的靜脈血2～3 mL，EDTA-K2抗凝，置于4 ℃保存。采用配套核酸提取試劑盒提取并純化DNA。采用Qubit3.0核酸定量儀定量DNA濃度，取DNA濃度高于50 ng/μL、吸光度(A260/280 nm)值為1.7～2.0的樣本，置于-20 ℃保存。

1.3.2實時熒光PCR擴增 按照人CYP2C19基因多態性檢測試劑盒(熒光PCR法)說明書檢測CYP2C19基因*2(c.681 G/A)位點與*3(c.636 G/A)位點單核苷酸多態性。PCR反應體系為每個樣本各準備4支PCR反應管，分別加入2G、2A、3G、3A的PCR反應液23 μL(含PCR 緩沖液、特異性引物和探針、內參引物和探針)，5 U/μL Taq DNA聚合酶1 μL，樣本DNA 1 μL。使用試劑盒自帶的質控品進行陰、陽性對照。采用ABI 7500實時熒光定量PCR儀進行擴增。循環參數：95 ℃預變性3 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，65 ℃ 45 s，10個循環；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，65 ℃ 45 s，30個循環；25 ℃ 1 min。設置FAM和ROX雙通道采集熒光信號。對于DNA樣本檢測反應體系，其內參擴增曲線的Ct(ROX)值應≤20，在內參Ct(ROX)值正常的情況下，計算樣本檢測信號Ct(FAM)值與內參信號Ct(ROX)值的差值，即△Ct=|Ct(FAM)-Ct(ROX)|。根據△Ct值判斷基因型，2G和2A反應體系：當△Ct≤5時提示等位基因G或A陽性，當△Ct>5 或Ct(FAM)顯示“Undetermined”時提示G或A陰性；3G和3A反應體系：當△Ct≤7時提示等位基因G或A陽性，當△Ct>7 或Ct(FAM)顯示“Undetermined”時提示G或A陰性。最后根據等位基因G和A的結果組合成相應的基因型。

1.3.3Sanger測序 取上述20例患者的DNA標本，送六合華大基因科技公司上海分公司進行Sanger測序。測序儀器為ABI 3730XL高通量分析儀，測序片段分別為CYP2C19*2(exon5)：atatacaatatattttatttatatttatagttttaaattacaaccagagcttggcatattgtatctatacctttattaaatgcttttaatttaataaattattgttttctcttagatatgcaataattttcccactatcattgattatttcccgggaacccataacaaattacttaaaaaccttgcttttatggaaagtgatattttggagaaagtaaaagaacaccaagaatcgatggacatcaacaaccctcgggactttattgattgcttcctgatcaaaatggagaaggtaaaatg；CYP2C19*3(exon4)：ctgtgatcccactttcatcctgggctgtgctccctgcaatgtgatctgctccattattttccagaaacgtttcgattataaagatcagcaatttcttaacttgatggaaaaattgaatgaaaacatcaggattgtaagcaccccctggatccaggtaaggccaagttttttgcttcctgagaaaccacttacagtctttttttctgggaaatccaaaattctatattgaccaagccctgaagtacatttttgaatactacagtcttgcctagacagccatggggtgaatatctggaaaag。符合率≥95%為驗證通過。將測序結果的2個位點基因型(加粗斜體標注)與熒光PCR檢測的基因型進行對比分析，以確定熒光PCR檢測結果是否為目的片段及相應的等位基因。

2 實驗與結果

2.1符合率 采用人CYP2C19基因多態性檢測試劑盒對上述已知的20例患者基因型樣本進行實時熒光PCR方法檢測，另取患者的DNA標本進行Sanger測序。結果表明，20例樣本經過實時熒光定量PCR和Sanger測序后，共檢測出5種基因型組合，包含*1/*3(c.681 GG，c.636GA)基因型3例；*1/*2(c.681 GA，c.636GG)基因型5例； *2/*2(c.681 AA，c.636GG)基因型3例；*2/*3(c.681 GA，c.636GA)基因型3例；*1/*1(c.681 GG，c.636GG)基因型6例；實時熒光PCR及Sanger測序結果完全一致，符合率為100%。見圖1。

注：實時熒光PCR法中，FAM通道為檢測通道，ROX為內參通道。Sanger測序圖中紅圈標識位置為CYP2C19 c.681和c.636位點的突變基因。A，*1/*3(c.681 GG，c.636GA)基因型；B，*1/*2(c.681 GA，c.636GG)基因型；C，*2/*2(c.681 AA，c.636GG)基因型；D，*2/*3(c.681 GA，c.636GA)基因型；E，*1/*1(c.681 GG，c.636GG)基因型。

2.2精密度

表1 CYP2C19實時熒光定量PCR精密度驗證結果

2.3檢出限 選擇2例測序驗證基因型為CYP2C19c.681GA、c.636GA的雜合型臨床標本，原始DNA濃度分別為51.13 ng/μL和50.76 ng/μL。參考試劑盒說明書“參考品(雜合子)最低檢測下限低至10 ng/μL”，將這2例標本的DNA溶液用DNA洗脫液進行等比稀釋，稀釋后的DNA濃度分別為30.15 ng/μL、17.33 ng/μL、9.95 ng/μL和29.42 ng/μL、17.55 ng/μL、9.90 ng/μL。將稀釋后的最低濃度核酸樣本設置5個復孔進行PCR基因型檢測，5次檢測的基因型結果與未稀釋原濃度水平的基因型結果符合率達100%時為驗證通過。結果表明，按照說明書提示的最低濃度重復檢測5次后的基因型與未稀釋原濃度水平的基因型符合率為100%，驗證通過。

2.4抗干擾能力 選擇1例測序驗證基因型為CYP2C19c.681GA、c.636GA的臨床血液標本，分裝成10份樣本，每份200 μL，其中1份不添加任何干擾物質，作為對照組，其余9份平均分為3組，每組分別加入3種干擾物質——氯化血紅素、膽紅素和膽固醇，配制成血紅蛋白終濃度為20 g/L，總膽紅素終濃度為60 μml/L，總膽固醇終濃度為10.2 mmol/L的溶血、黃疸及脂血標本。提取這10份樣本的DNA進行PCR基因型檢測，實驗組和對照組檢測結果的符合率≥90%為抗該干擾能力驗證通過。結果發現：加入氯化血紅素、膽紅素和膽固醇之后的標本的基因型與對照組基因型符合率為100%，即這3種干擾物質在試劑盒標注的濃度下，對基因型判斷沒有影響，驗證通過。見表2。

表2 CYP2C19實時熒光定量PCR抗干擾能力驗證結果

3 討論

為了保證日常檢驗項目的質量控制工作及檢驗結果的準確、可靠。本研究從符合率、精密度、檢出限和抗干擾能力4個方面對蘇州曠遠生物分子技術公司的人CYP2C19基因多態性檢測試劑盒(熒光PCR法)進行了性能驗證。

符合率驗證為本試劑盒基因型檢驗結果與參考方法Sanger測序方法的結果一致性檢驗，反映了檢驗結果的準確性，是確保檢驗結果準確發出的前提和重要環節。本研究中納入了甘肅地區漢族人群中檢出的5種基因型組合，涵蓋了CYP2C19所能檢出的全部基因型。對5種類型的基因型組合進行驗證后發現，兩種方法的結果完全一致。

精密度驗證分為期間精密度和重復性的驗證，反映了檢測結果的再現性，是保證良好準確度的先決條件，也是反應實驗室室內質控穩定性的重要指標，本研究重復性和期間精密度的CV值均小于5%，表明基因型判斷結果穩定、可靠。

檢出限驗證反映了能檢測出基因型的最低的樣本核酸濃度，本試劑盒的說明書中最低檢出限為10 ng/μL，本次驗證將核酸濃度稀釋到略低于10 ng/μL，經過連續5次重復擴增之后，依然可以保證基因型的準確判斷。抗干擾能力驗證反映了臨床樣本發生溶血、黃疸或脂血時能否正確判定基因型的能力，因臨床標本中既要符合溶血、黃疸或脂血又要符合雜合突變基因型的樣本數量極少，故而本實驗根據試劑盒說明書中的濃度將臨床樣本進行了處理，配制成了不同濃度的溶血、黃疸或脂血樣本，并未影響基因型的準確判斷。

本次驗證的不足之處在于考慮到實際檢測的時效性，加之本實驗已完成驗證過程，未對更低的核酸濃度進行基因型檢測的嘗試；若條件允許，應適當增加精密度驗證的天數，使期間精密度檢測數據更加完善。