高產纖維素酶菌株的篩選及產酶條件優化

傅科鶴 范莉莉 陳慧穎

摘要：纖維素是自然界中分布最廣泛的一種生物質能源，篩選能夠高效降解纖維素的菌株對于開發利用這類物質具有重要意義。從土壤中分離純化獲得一株高產纖維素酶的菌株TW063-3，通過形態學結合分子生物學鑒定得出，該菌株為草酸青霉。通過單因素優化試驗尋找最佳培養條件，然后通過正交試驗確定關鍵因子的最佳參數。篩選得出最佳培養條件：15 g/L羧甲基纖維素鈉+2 g/L硝酸銨，pH值為3.0，200 r/min培養6 d。在最佳培養條件下，酶活性比優化前提高了34.1%，達到524.4 U/mL。研究結果可為生物降解纖維素酶提供一定的理論及應用價值。

關鍵詞：纖維素酶;草酸青霉;培養基優化

纖維素酶能夠將自然界中最豐富的生物質能源——纖維素類物質分解成可溶性單糖，從而為大批量生產生物燃料乙醇提供廉價原料[1]。經過50多年的研究發現，纖維素酶已經成為第四大工業酶種[2]，在生物能開發、食品、畜牧業及工農業廢棄物回收等多個領域都具有遠大的應用前景[3]。

已有研究發現，自然界中能分解纖維素的生物類群主要是細菌與真菌[4]。絲狀真菌是產纖維素酶非常重要的一大類群，能夠產生多種胞外纖維素酶[5]。里氏木霉是研究得較為清楚的產纖維素酶菌株，但是其生長量相對較小，產酶量不能滿足工業中轉化纖維素的需求[6]。許多研究發現，青霉菌具有胞內分泌組分齊全、纖維素酶活性高、易培養和生長速度快的優勢[7]，而且青霉源纖維素酶能產生比木霉源纖維素酶較多的β-葡萄糖苷酶[8]。

本研究從海灘邊土壤篩選獲得一株高產纖維素酶的青霉菌株，通過優化培養條件，旨在提高該菌株的纖維素酶產量，研究成果可為今后工業化應用纖維素酶提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 剛果紅篩選培養基 培養基配方為10 g/L羧甲基纖維素鈉，0.2 g/L剛果紅，2 g/L K2HPO4·3H2O，0.01 g/L FeSO4·7H2O，0.5 g/L MgSO4·7H2O，0.5 g/L KCl，14 g/L瓊脂。

1.1.2 搖瓶發酵培養基 培養基配方為10 g/L羧甲基纖維素鈉，3 g/L蛋白胨，0.5 g/L酵母粉，4 g/L （NH4）2SO4，2 g/L K2HPO4·3H2O，0.3 g/L CaCl2，0.5 g/L MgSO4·7H2O，2 g/L吐溫-80。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集與處理 土壤樣品從海洋和森林中采集，取5點采樣，混合為1個樣品。在樣品中加入適量純凈水后，加玻璃珠打散，取上層液體，稀釋后涂板篩選。

1.2.2 纖維素酶活性的測定 采用DNS（3，5-二硝基水楊酸）法測定纖維素酶活性。對照（CK）處理方法：取1 mL菌液，煮沸（100 ℃、5 min）滅活后用冷水冷卻5 min，之后加入1 mL 1%羧甲基纖維素鈉溶液和3 mL DNS，混合均勻后沸水（100 ℃、5 min）水浴，再用冷水冷卻5 min，然后在波長（λ）為540 nm的紫外-可見分光光度計中測吸光度。

酶活性的測定：取1 mL菌液，加入1 mL 1%羧甲基纖維素鈉溶液，混合均勻后在37 ℃水浴鍋中水浴30 min，煮沸（100 ℃、5 min）滅活后用冷水冷卻 5 min，再加入3 mL DNS溶液，混合均勻后沸水（100 ℃、5 min）水浴，再用冷水冷卻5 min。每組測定吸光度前用其對應的CK清零后再測定540 nm處的吸光度，每瓶設3次重復。酶活性單位的定義：催化產生1 μg葡萄糖的酶量為1 U[9]。

酶活性（U/mL）=D540 nm×n×1 000/K。

式中：n為稀釋倍數;K為標準曲線斜率。

1.2.3 高產纖維素酶菌株的篩選 將菌株活化后接種至剛果紅初篩平板上，于28 ℃恒溫培養箱中培養。待初篩獲得的高產漆酶菌株活化產孢后，用3層擦鏡紙過濾獲得孢子，稀釋至1×104 個/mL，在每瓶培養基（250 mL三角瓶裝量50 mL）中接入1 mL孢子懸液，28 ℃、200 r/min培養5 d后測定酶活性。

1.2.4 發酵產酶條件的優化

1.2.4.1 碳源的優化 對經搖瓶復篩得到的最佳菌株進行培養基的優化，其中發酵培養基的碳源分別取10 g/L羧甲基纖維素鈉、10%葡萄糖、10%淀粉、10%蔗糖進行篩選，其余條件不變，發酵5 d后測定酶活性，確定最佳碳源。

1.2.4.2 氮源的優化 將發酵培養基的碳源改為最適碳源，分別取2 g/L硝酸鈉、硫酸銨、氯化銨、硝酸銨、蛋白胨進行初始發酵培養基最適氮源的篩選，其余條件不變，發酵5 d后，測定酶活性，確定最佳氮源。

1.2.4.3 pH值的優化 取最適碳源和氮源，pH值分別設為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5，其余條件不變，發酵5 d后，測定酶活性，確定最佳pH值。

1.2.4.4 發酵培養時間的優化 選擇優化后的最佳培養基進行發酵培養，從培養2 d開始，每天測定1次纖維素酶活性，確定最佳培養時間。

1.2.4.5 正交優化 依據單因素試驗結果，選擇碳源、氮源、pH值和生長時間，設計4因素4水平正交試驗[10]，采用 L16（44）正交表。

1.2.5 菌種的鑒定

1.2.5.1 形態學的鑒定 將菌種TW063-3活化后，接1小塊菌餅到CYA平板上，于28 ℃培養3 d產孢后，挑取少量帶孢子的菌絲置于載玻片上，顯微觀察并拍照。

1.2.5.2 分子生物學鑒定 DNA提取參照生工生物工程（上海）股份有限公司（Sangon Biotech）DneasyPlant Mini Kit（50）的試劑盒。采用真菌18S rDNA通用引物ITS1f（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）、ITS4R（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）擴增ITS（內轉錄間隔區）序列，PCR擴增程序：94 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，33個循環;72 ℃10 min。經生工生物工程（上海）股份有限公司測序后通過MEGA 7構建系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 高產纖維素酶菌株的篩選

本研究共分離純化164株菌株，通過初篩獲得6株纖維素酶活性最高的菌株（圖1）。復篩結果表明，菌株TW063-3（P=8.73e-10<0.01）的纖維素酶活性最高，為268.2 U/mL。因此，選取TW063-3進行后續研究。

2.2 高產纖維素酶菌株的分類鑒定

2.2.1 形態學鑒定 菌株活化后接種于CYA培養基上培養3 d產孢后，挑取菌絲進行顯微觀察，結果見圖2。觀察發現，菌落呈灰綠色，邊緣為白色，多分生孢分散形成許多小菌落（圖2-A）;分生孢子梗多次分枝后出現多簇對稱或不對稱的小梗，形如掃帚，具有隔膜且多個分支。分生孢子大多為球形和橢圓形，生長時為藍綠色（圖2-B～圖2-D），因此初步鑒定TW063-3為青霉菌。

2.2.2 分子生物學鑒定 TW063-3序列通過NCBI

BLAST進行序列比對，通過MEGA 7的NJ法構建系統進化樹。由圖3可以看出，TW063-3與草酸青霉的同源性都為99%，可靠性為100%。綜合形態學鑒定結果，確定TW063-3為草酸青霉（NCBI登錄號：MT020385）。

2.3 產酶條件優化

2.3.1 最佳碳源 如圖4所示，以羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）為碳源時，纖維素酶活性最高，為33015 U/mL（P=0.016 7<0.05）。而葡萄糖和淀粉2種碳源產酶活性差異不顯著。因此選擇羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）作為最佳碳源。

2.3.2 最佳氮源 如圖5所示，以硝酸銨為氮源的酶活性與除蛋白胨外其他3種氮源的差異不顯著，但是其生長量（P=0.004 24<0.01）比其他3種氮源高（圖6）。因此，選擇硝酸銨作為最佳氮源。

2.3.3 最適pH值 pH值為3.5時，酶活性顯著低于其他4種pH值（P=0.000 154<0.01），pH值為4.0的酶活性與pH值4.5、5.0時差異顯著，pH值為4.5、5.0、5.5的酶活性差異不顯著，其中pH值為5.0時酶活性最高。因此，選則pH值5.0為產酶的最佳pH值，酶活性為300.9 U/mL（圖7）。

2.3.4 最佳培養時間 確定該菌株最佳培養基后，從培養2 d開始，每天測定1次菌株所產纖維素酶活性，培養7 d結束。如圖8所示，TW063-3菌株在培養4 d時酶活性最高，在培養5 d時酶活性下降，但是培養6 d又開始上升，在培養7 d開始小幅度下降。而培養4 d與培養6 d的酶活性差異不顯著，培養6 d與培養3 d的酶活性差異不顯著，培養 2 d 與培養7 d的酶活性差異不顯著，培養4 d的酶活性為300.42 U/mL，高于培養6 d的酶活性。因此， 選擇培養 4 d 作為 TW063-3 產纖維素酶的最

佳培養時間。

2.3.5 正交優化 依據單因素試驗結果，選擇羧甲基纖維素鈉（A，設5、10、15、20 g/L 4個水平）、硝酸銨（B，設2、4、6、8 g/L 4個水平）、pH值（C，設3、4、5、6 4個水平）和培養時間（D，設3、4、5、6 4個水平）設計4因素4水平正交試驗，采用 L16（44） 型正交設計。正交試驗結果的極差分析表明，影響酶活性的4個因素排序為培養時間（D）>pH值（C）>碳源（A）>氮源（B），對于A因素，由于k3>k1>k4>k2，所以取A3，同理，B因素取B1，C因素取C1，D因素取D4，其最優組合為A3B1C1D4（表1），即產纖維素酶最佳培養基組合為15 g/L羧甲基纖維素鈉+2 g/L硝酸銨，pH值為3.0，培養時間為6 d。

由于正交極差分析表中培養組合為A1B4C1D4的酶活性最高，因此選取A1B4C1D4、A3B1C1D4的培養條件進行驗證試驗。結果表明，組合A3B1C1D4的培養條件下培養的TW063-3產生的纖維素酶活性高達524.4 U/mL。由此，確定培養條件的最佳組合為A3B1C1D4。

3 結論

纖維素是自然界中分布最廣、產量最大的多糖類物質，由于其多糖結合的高聚合性及復雜性，導致這類最豐富的資源一直無法得到充分開發利用。

近幾十年來，相關研究熱點一直集中于如何充分開發利用這類資源[11-12]，而篩選1株高產纖維素酶的菌株是纖維素資源充分開發利用的基礎工作，相關成果將為纖維素的利用奠定理論依據。目前已經發現，細菌、放線菌與真菌等多種生物都能夠分泌豐富的纖維素復合酶體系為分解利用纖維素提供能量[13]。其中真菌纖維素酶由于種類全、活性高、作用底物廣等特點被廣泛開發成商業化的酶系[14]。

本研究從廈門海灘邊土壤中分離出的1株能夠高效分解纖維素的絲狀真菌TW063-3，通過一系列形態學分析及分子生物學鑒定，確定該菌株為青霉屬真菌。通過單因素優化結合正交試驗設計，確定該菌株最佳產纖維素酶培養條件為15 g/L羧甲基纖維素鈉+2 g/L硝酸銨，pH值為3.0，轉速為200 r/min，培養時間為6 d。優化后的酶活性比優化前提高了34.1%，達到524.4 U/mL。研究成果為進一步研究纖維素酶降解機制及工業化發酵產酶提供一定的理論基礎。

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