基于Bax/Bcl-2-Caspase-3通路芍藥軟肝方抑制裸鼠肝癌生長及機制研究

李駿飛 鄭小蓉 姜建偉 章紅燕

中國科學院大學附屬腫瘤醫院（浙江省腫瘤醫院）? 中國科學院基礎醫學與腫瘤研究所，浙江杭州? ?310022

[摘要] 目的 研究芍藥軟肝方（SRF）調控Bax/Bcl-2-Caspase-3通路抑制肝癌生長的作用及機制。 方法 建立HepG2荷瘤裸鼠模型，隨機分為空白對照組、高、中、低濃度芍藥軟肝方（SRF）組，灌胃3周后稱取瘤重，TUNEL法觀察腫瘤細胞凋亡情況，Western-blot法檢測對組織中NF-κB-p65、VEGF、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白質表達。 結果 （1）不同濃度芍藥軟肝方（SRF）均可抑制HepG2荷瘤裸鼠體內肝癌腫瘤的生長，并能誘導腫瘤細胞凋亡;（2）SRF可降低裸鼠肝癌組織中NF-κB-p65、VEGF、Bcl-2蛋白表達，上調Bax、Caspase-3蛋白表達。上述作用均呈濃度依賴。 結論 SRF可顯著抑制HepG2荷瘤裸鼠腫瘤生長并促進腫瘤細胞凋亡，且作用呈濃度依賴。其機制可能通過調控Bax/Bcl-2-Caspase-3通路與抑制信號通路上游NF-κB-p65及VEGF等因子的蛋白質表達有關。

[關鍵詞] 芍藥軟肝方;肝癌;HepG2;分子機制

[中圖分類號] R735.7? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2021）07-0038-04

Study of the inhibitory effect of Shaoyao Ruangan Formula on the growth of liver cancer in nude mice based on Bax/Bcl-2-Caspase-3 pathway and its mechanism

LI Junfei? ?ZHENG Xiaorong? ?JIANG Jianwei? ?ZHANG Hongyan

The Cancer Hospital of the University of Chinese Academy of Sciences（Zhejiang Cancer Hospital）， Institute of Basic Medicine and Cancer （IBMC）， Chinese Academy of Sciences， Hangzhou? 310022， China

[Abstract] Objective To study the effect and mechanism of Shaoyao Ruangan Formula（SRF） regulating Bax/Bcl-2-Caspase-3 pathway to inhibit the growth of liver cancer. Methods HepG2 tumor-bearing nude mouse models were established and randomly divided into the blank control group， the high， medium and low concentration SRF group. After three weeks of gastric perfusion， the tumors were weighed， the apoptosis of tumor cells was observed through the TUNEL method， and the protein expressions of NF-κB-p65， VEGF， Bcl-2， Bax and Caspase-3 in the tissues of different groups were detected by Western-blot method. Results （1）All SRF at variant concentrations can inhibit the growth of liver cancer in HepG2 tumor-bearing nude mice and induce the apoptosis of tumor cells; （2）SRF can decrease the protein expressions of NF-κB-p65， VEGF and Bcl-2 in liver cancer tissues of nude mice， and up-regulate the protein expressions of Bax and Caspase-3. The above-mentioned effects were all in a concentration-dependent manner. Conclusion SRF can significantly inhibit the growth of tumors in HepG2 tumor-bearing nude mice and promote the apoptosis of tumor cells in a concentration-dependent manner. The mechanism may be related to the inhibition of protein expressions of NF-κB-p65 and VEGF， etc. in the upstream of signaling pathway by regulating Bax/Bcl-2-Caspase-3 pathway.

[Key words] Shaoyao Ruangan Formula; Liver cancer; HepG2; Molecular mechanism

肝細胞癌（以下簡稱肝癌）是一種發病率與死亡率均較高的惡性腫瘤疾病。據統計，2018年全球肝癌患者新發約84.4萬，死亡約78.2萬，其新發與死亡比接近1∶1，分列36種常見癌癥中的第6位及第4位[1]。我國是肝病大國，肝癌的新發率與死亡率更是常年居高不下，2015年我國肝癌患者新發39.2萬余，死亡36.8萬余，均位居第3位[2-4]。因此，肝癌的預防、治療始終是當今醫學界重點關注的關鍵問題之一。

中醫中藥治療是公認的有效肝癌防治方式，亦是目前臨床抗肝癌藥物研發的熱點之一。芍藥軟肝方（Shaoyao Ruangan Formula，SRF）是由我院多位中醫師依據臨床治療經驗共同總結、研發的中藥抗肝癌協定方（當前已開發為院內中藥制劑，批準文號：浙藥制Z20050184。曾用名：中肝合劑）。全方由白芍、三葉青、重樓、仙鶴草、白茅根、郁金、三棱、路路通等19味中藥組成，具有清熱解毒、行氣健脾等功效，對原發性肝癌療效顯著，受到患者與臨床醫生的廣泛認可，臨床使用超過40年[5]。前期實驗已證實了SRF具有抗H22肝癌裸鼠腫瘤及延長患癌裸鼠生存期的作用，且初步揭示其抗腫瘤機制可能與抑制腫瘤細胞增殖及誘導細胞凋亡相關[6]。但由于H22肝癌屬于鼠源性肝癌，與人源性肝癌有較大差異，且SRF的抗腫瘤作用及機制至今尚未被完全闡明。因此本研究在前期研究基礎上，以人源性HepG2細胞及相應裸鼠肝癌移植瘤模型為載體，圍繞SRF對Bax（BCL-2-associated X protein）/B淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）-半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）通路及上游細胞核因子κB（Nuclear factor kappa-B，NF-κB）-NF-κB-p65及血管內皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）表達的調控作用而進一步闡釋該方抗肝癌的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料來源

1.1.1 動物與瘤株? 裸鼠20只，均3周齡，體重（20±2）g，雌雄各半，由上海斯萊克實驗動物公司提供，生產許可SCXK（滬）2017-0005。HepG2細胞株由中國科學院上海細胞庫提供。

1.1.2 實驗藥物制備? 芍藥軟肝方由中國科學院大學附屬腫瘤醫院（浙江省腫瘤醫院）提供，藥物低、中、高濃度為5 mL/kg、10 mL/kg、20 mL/kg。

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器? DnaseI（Promega）、Bst DNA Polymerase（NEB）、總蛋白提取試劑盒（南京凱基生物）、BCA蛋白定量試劑盒（天根）、PVDF（merck）、SDS-PAGE制備試劑盒（杭州寶賽生物）。美國Agilent Stratagene Mx3005P熒光定量PCR儀、Bio-RAD垂直蛋白電泳和轉膜儀、美國Bio-RAD公司Mini-PROTEAN Tetra Electrophoresis system、Bio-RADMini-sub cell GT水平電泳槽、AndyBio M-centrifuge微型離心機。Bcl-2抗體（艾博抗上海貿易有限公司），批號ab692;Bax抗體（艾博抗上海貿易有限公司），編號ab7977;VEGF抗體（艾博抗上海貿易有限公司），編號ab69479;Caspase-3抗體（艾博抗上海貿易有限公司），批號ab32351;NF-κB-p65抗體（艾博抗上海貿易有限公司），批號ab76302;β-actin抗體（艾博抗上海貿易有限公司），批號ab63982。

1.2.2 模型制備及分組? 培養HepG2細胞至對數期，超凈臺內無菌條件下生理鹽水稀釋配制成細胞懸液備用。取裸鼠，左腋下注射2×107個HepG2細胞，制備HepG2肝癌裸鼠模型，共20只。實驗共分為四組，每組5只，分別為SRF高、中、低劑量組及空白對照組，給藥組按劑量每日灌胃1次，空白對照組給予10 mL生理鹽水灌胃，連續給藥3周后處死裸鼠。

1.2.3 取材? 摘除裸鼠移植瘤，拍照、稱重，將非壞死部分凍存。

1.3 觀察指標

1.3.1 TUNEL法檢測腫瘤細胞凋亡? 取肝臟腫瘤組織置10%甲醛溶液中固定，脫水后石蠟包埋并常規切片。按試劑盒說明書提示步驟操作對石蠟切片進行檢測，以細胞核染成綠色的細胞為凋亡細胞，顯微鏡下觀察細胞凋亡情況。

1.3.2 Western-blot法檢測腫瘤組織中VEGF、NF-κB-p65、Bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白質表達? 取腫瘤組織0.5 g制備細胞裂解液，按照全蛋白提取試劑盒提示按步驟提取樣品總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定濃度，20 μg蛋白質SDS-PAGE電泳，轉模，5%脫脂奶粉4℃封閉過夜。一抗室溫孵育2 h，TBST漂洗濾膜3次，每次10 min，TBS洗滌1次10 min。二抗室溫孵育1 h，TBST洗滌液洗滌3次，每次10 min，TBS洗滌1次10 min。DAB顯色液臨用時配制。洗凈后的PVDF膜放入顯色液中反應3 min（注意觀察），用水終止反應，成像儀攝片，測定腫瘤組織中VEGF、NF-κB-p65、Bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白質表達。

1.4 統計學方法

實驗數據使用SPSS 23.0統計學軟件進行處理，計量資料以（x±s）表示，多組間資料比較采用方差分析，兩組比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SRF各組干預HepG2荷瘤裸鼠腫瘤重量比較

SRF給藥組腫瘤體積及重量均小于空白對照組?？瞻讓φ战M裸鼠平均瘤重為（1.73±0.28）g、低劑量組瘤重為（1.10±0.17）g、中劑量組瘤重為（0.78±0.03）g、高劑量組瘤重為（0.45±0.04）g，其中中、高劑量組與空白對照組比較，差異有統計學意義（P<0.05），說明中、高濃度SRF具有顯著抑制HepG2荷瘤裸鼠肝癌生長的作用，且呈濃度依。

2.2 SRF各組干預HepG2荷瘤裸鼠腫瘤組織細胞凋亡情況比較

TUNEL法檢測鏡下空白對照組熒光細胞僅零星可見，說明僅有少量細胞凋亡。SRF各組熒光細胞均明顯多于空白對照組，且凋亡細胞數量隨藥物濃度升高而增多，高濃度組已呈現大片熒光細胞，說明腫瘤細胞凋亡程度最高。

2.3 Western-blot實驗

與空白對照組相比，SRF各組干預后腫瘤組織樣本中VEGF、NF-κB-p65、Bcl-2等因子蛋白質表達水平降低而Caspase-3及Bax因子蛋白質表達水平提高，且均呈濃度依賴。

3 討論

肝癌的發生、發展或轉移受到多因素、多階段、多基因的共同調控[7]。腫瘤細胞出現凋亡抑制及失控性無限制增殖被視為肝癌發生與惡化的重要機制[8]。Bax和Bcl-2是B細胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）蛋白家族的成員，在細胞凋亡的調控中發揮著重要作用。Bax與Bcl-2是一對具有相互拮抗作用的同源調控因子，它們形成二聚體后通過改變線粒體外膜的通透性誘導細胞凋亡[9，10]。Bax又稱造孔蛋白，激活后在線粒體膜外膜形成孔洞，導致膜完整性喪失和細胞色素釋放[11]，因此Bax是重要的促凋亡因子，參與線粒體凋亡途徑，而抗凋亡因子Bcl-2可抑制Bax的功能。簡言之，Bax可促進細胞凋亡，Bcl-2則抑制凋亡，Bax及Bcl-2間的比率決定了它們誘導凋亡作用的強弱，當Bcl-2表達顯著增加時，腫瘤細胞將表現出明顯的凋亡抑制現象[12，13]。Caspase是細胞凋亡通路中另一類關鍵調控因子，它們具有促細胞凋亡作用[14]，通常可分為啟動型，包括：Caspase-2、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-10和效應或執行型，包括：Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7[15]。當Bax/Bcl-2二聚體中Bax表達增加時將激活Caspase-9，然后Caspase-9又通過酶切酶原激活Caspase-3，促使Caspase-3進行剪切，從而開啟凋亡級聯反應，催化多種關鍵細胞蛋白分解，使細胞凋亡[16，17]。因此，Bax/Bcl-2-Caspase-3是腫瘤細胞凋亡過程中常見的重要調控因子[18]。

NF-κB是一種由50 ku和65 ku蛋白組成的異源二聚體，在正常條件下與IκBs形成復合物，保持在靜息狀態[19]。當受到外界因素，如缺氧、細胞因子、病毒蛋白、有絲分裂原和紫外線等刺激時，IκBs被降解，形成三聚體復合物中的IκB被磷酸化，與NF-κB解離，隨后NF-κB進入細胞核，作用于靶因子，發揮其功能[19-20]。NF-κB是一種具有多向調節功能的轉錄因子，可調控多種基因的表達，如凋亡相關基因、癌基因、腫瘤轉移相關黏附分子、細胞外基質蛋白酶等，尤其是上調VEGF基因的表達，在腫瘤細胞的發展過程中扮演重要作用，與腫瘤的發生、浸潤和轉移密切相關[21]。研究表明，NF-κB活化在肝癌發生發展中起著關鍵的作用，是肝癌細胞凋亡的關鍵因子[22-23]?；罨腘F-κB可增加抗凋亡基因Bcl-2的表達，抑制促凋亡蛋白Bax表達[24]。因此Bax/Bcl-2-Caspase-3信號通路受到NF-κB及VEGF等上游因子的調控。實驗發現當NF-κB表達受到抑制時，Bax/Bcl-2-Caspase-3通路中Bax及Caspase-3等促凋亡因子表達將顯著上調，進而促使腫瘤細胞凋亡[25]。VEGF是促進腫瘤周圍及新血管生成、控制腫瘤微環境的關鍵調控因子，在肝癌中呈高表達，對腫瘤的發生、發展及凋亡均有重要作用[26]。研究表明，當腫瘤細胞出現缺氧適應性反應時，缺氧誘導因子-1α（Hypoxia inducible factor-1，HIF-1α）/VEGF通路被激活，繼而通過調控Bax/Bcl-2/Caspase-3通路促使腫瘤細胞出現凋亡抑制反應[27]。Song等[28]研究則進一步闡明，ROS-NF-κB信號通路位于HIF-1α/VEGF通路上游，并對其具有調控作用。因此，認為在肝癌的發生及惡性化過程中可能存在NF-κB/VEGF/Bax/Bcl-2-Caspase-3信號通路調控肝癌細胞的凋亡機能。

SRF全方由19味中藥組成，其中麩白芍、郁金柔肝利膽，行氣解瘀，重樓、白花蛇舌草、白毛藤、三葉青、半枝蓮解毒散結，清熱消腫，莪術、三棱行氣化瘀，破血消積，金錢草、白茅根利尿消腫，陳皮、青皮理氣降逆，焦山楂、炒雞內金消積健脾，以其為基礎開發的院內制劑芍藥軟肝合劑一直是我院治療肝癌的臨床常用藥物之一，深受醫師及患者青睞，但其作用機制尚未闡明。基于芍藥軟肝方在臨床中的療效，本文設計了相關實驗，利用各種實驗方法探討其在動物水平方面研究其抗腫瘤機制。最終本實驗結果發現，SRF可顯著抑制HepG2荷瘤裸鼠腫瘤組織生長，且抑制效果呈濃度依賴性，其中以高濃度SRF作用最強。TUNEL法檢測腫瘤細胞凋亡發現，不同濃度的SRF都可以促進HepG2細胞的凋亡，也隨著濃度的增加而加強。Western-blot研究顯示SRF可抑制腫瘤組織中NF-κB、VEGF及Bcl-2蛋白表達，上調Bax、Caspase-3蛋白表達。

綜上所述，SRF在動物水平可起到較好的抗腫瘤作用，其機制可能通過抑制腫瘤細胞NF-κB及VEGF的蛋白質表達來調控Bax/Bcl-2/Caspase-3信號通路，從而誘導腫瘤細胞凋亡。

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（收稿日期：2020-05-06）