電針對早期膝骨關節炎兔模型關節軟骨病理及黏彈性力學性能的影響

史曉偉　烏云額爾頓　王東峰　王彤　王春久　郭長青　史術峰

〔摘要〕 目的 探索電針治療對早期膝骨關節炎（knee osteoarthritis， KOA）兔模型關節軟骨病理及黏彈性力學性能的影響。方法 33只新西蘭兔按體質量隨機分為空白組（6只）及KOA造模組（27只），KOA造模組應用改良Videman法（過伸位制動）制動4周建立早期KOA兔模型，拆除固定裝置后根據Lequesne評分再隨機分為模型組、電針組和西藥組（每組9只），均干預4周。干預結束后，兔股骨內側髁軟骨分別進行番紅0/固綠染色及黏彈性力學性能（納米壓痕儀）檢測。結果 （1）與空白組相比，模型組Mankin評分顯著升高（P<0.01）;干預治療后與模型組相比，電針組Mankin評分顯著降低（P<0.01），西藥組Mankin評分明顯降低（P<0.05）。（2）與空白組相比，模型組股骨軟骨儲存模量（storage modulus， SM）平均值顯著升高（P<0.01）;干預治療后與模型組相比，電針組、西藥組股骨軟骨SM平均值表達顯著降低（P<0.01）。（3）與空白組相比，模型組軟骨損失模量（loss modulus， LM）平均值顯著升高（P<0.01）;干預治療后與模型組相比，電針組、西藥組軟骨平均LM值表達顯著降低（P<0.01）。（4）與空白組相比，模型組損失因子（loss factor， LF）表達升高;干預治療后與模型組相比，電針組和西藥組LF值表達升高，但差異均無統計學意義（P>0.05）。結論 電針干預早期KOA兔模型，具有減輕關節軟骨病理損傷、改善關節軟骨SM和LM的作用。

〔關鍵詞〕 膝骨關節炎;關節軟骨;電針;番紅O/固綠染色;納米壓痕

〔中圖分類號〕R245.9? ? ? ? 〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.01.013

〔Abstract〕 Objective To explore the effects of electroacupuncture on articular cartilage pathology and viscoelastic mechanical properties in a rabbit model of early knee osteoarthritis （KOA）. Methods 33 New Zealand rabbits were randomly divided into the blank group （6 rabbits） and the KOA model group （27 rabbits） according to the body weight. In the KOA model group， the modified Videman method （hyperextension braking） was applied for 4 weeks to establish the early KOA rabbit model. After removing the fixed device， the KOA rabbits were randomly divided into the model group， the electroacupuncture group and the drug group （9 rabbits in each group）. All groups were intervened for 4 weeks. After the intervention， the cartilage of medial femoral condyle was stained with safranin O/fast green and its viscoelastic properties were detected （nanoindentation instrument）. Results （1） Compared with the blank group， the Mankin score of the model group was significantly increased （P<0.01）; after intervention， compared with the model group， the Mankin score in the electroacupuncture group （P<0.01） and drug group （P<0.05） were significantly lower. （2） Compared with the blank group， the average storage modulus （SM） of femoral cartilage in the model group was significantly increased （P<0.01）; after intervention， compared with the model group， the average SM of femoral cartilage in the electroacupuncture group and drug group were significantly lower （P<0.01）. （3） Compared with the blank group， the expression of average loss modulus （LM） of cartilage was significantly increased （P<0.01）; after intervention， compared with the model group， the expression of average LM of femoral cartilage in the electroacupuncture group and drug group were significantly lower （P<0.01）. （4） Compared with the blank group， the expression of loss factor （LF） of the model group was increased; after intervention， compared with the model group， the expression of LF in the electroacupuncture group and drug group were increased. but the difference was not statistically significant （P>0.05）. Conclusion Electroacupuncture could reduce the pathological damage of articular cartilage and improve the SM and LM of articular cartilage in a rabbit model of early KOA.

〔Keywords〕 knee osteoarthritis; articular cartilage; electroacupuncture; saffron O/fast green staining; nanoindentation

膝骨關節炎（knee osteoarthritis， KOA）是一種臨床常見的慢性關節退行性疾病，主要臨床表現為膝關節疼痛及功能活動障礙等，其典型病理改變為膝關節軟骨退變以及病情進行性加重[1]。導致KOA的高危因素眾多，比如年齡、性別、職業等，其中膝關節承受異常的生物力是致病的重要原因[2]。在膝關節的穩定中，肌肉發揮動態保護作用，肌肉功能異常如肌萎縮、肌無力等會加速KOA進展[3]。既往研究證實，KOA患者多存在膝關節周圍肌肉萎縮或肌力降低的臨床表現，如股四頭肌、腘繩肌功能減退[4]。因此，通過改善膝周肌肉功能、調整膝關節異常的生物力學環境，可能是緩解KOA關節軟骨退變的良好策略。中醫診療專家共識（2015年版）推薦針灸治療KOA[5]，但其對膝關節軟骨是否具有保護作用有待研究。因此，本研究探索電針對早期KOA兔膝關節軟骨病理及黏彈性力學性能的影響，進一步為電針、針刀治療KOA提供動物實驗研究支持。

1 材料與方法

1.1? 實驗動物

33只健康清潔級新西蘭雄兔（6月齡，體質量2.5～3.0 kg）購買并飼養于北京金牧陽實驗動物有限公司（動物生產許可證號：SCXK 2015-0005，動物使用許可證號：SYXK 2015-0008），所有實驗動物單籠飼養[溫度（22±2） ℃，相對濕度45%±5%]并自由獲取食物和水。本實驗研究獲得北京中醫藥大學動物倫理委員會批準，實驗過程嚴格按照實驗動物管理規定進行。

1.2? KOA兔模型制備

KOA兔模型的原理為下肢過伸位固定制動法（改良Videman法），詳細造模方法參照本團隊前期研究[6-7]，簡要步驟包括：（1）兔左后肢伸直，醫用壓敏膠帶（0.9 cm寬;海氏海諾，青島海諾生物工程有限公司）纏繞左后肢;（2）泡沫雙面膠（10 mm厚;上海得力文具有限公司）覆蓋壓敏膠帶，范圍從腹股溝至膝蓋;（3）樹脂繃帶（150×1 800 mm;揭西縣泰洲醫療有限公司）沿泡沫膠范圍纏繞1周;（4）高分子固定繃帶（KNT04;可耐特，蘇州可耐特醫療科技有限公司）纏繞樹脂繃帶1周;（5）樹脂繃帶再固定、并亞敏膠帶捆綁。這樣就形成一個類似“石膏”樣的固定結構，連續制動4周。

1.3? 實驗分組及干預方法

33只新西蘭兔依據體質量，查隨機數字表，隨機分為空白組（6只）和造模組（27只）。空白組正常飼養，KOA造模組根據“1.2”方法進行動物模型制備。KOA兔制動4周后，拆除固定裝置，適應性飼養3 d，根據Lequesne MG評分[8]再隨機分為模型組、電針組和西藥組（每組9只）。干預方法：（1）空白組和模型組：每日正常抓取，同時給予純水3 mL灌胃，每日1次;（2）電針組：穴位選擇梁丘、血海、內膝眼、外膝眼、陰陵泉、陽陵泉、委中、曲泉（取穴參照《實驗針灸學》[9]），一次性無菌針灸針（0.2 mm×13 mm，環球牌）刺入，分別連接梁丘-委中，血海-曲泉進行電刺激（LH202H，韓牌電針儀;波形疏密波，頻率2/100 Hz，強度2 mA），每次20 min，隔天干預1次;（3）西藥組：給予塞來昔布（批號：國藥準字J20120063;西樂葆，0.2 g/片，輝瑞制藥有限公司）灌胃治療（溶于純水，10 mg/kg），每日1次。均干預治療4周。

1.4? 兔股骨內側髁軟骨番紅O/固綠染色

干預結束后，應用空氣栓塞法處死兔。快速鉗取兔股骨內側髁軟骨，4%多聚甲醛固定72 h后，浸入15%乙二胺四乙酸溶液中脫鈣2周。然后進行常規脫水、透明并石蠟包埋、切片等操作（軟骨切片厚度4 μm）。軟骨玻片進行番紅O/固綠染色，簡要步驟如下：（1）軟骨玻片在烤片機上65 ℃拷片1 h;（2）常規二甲苯脫蠟，梯度酒精水化后，浸入1%番紅O染液中30 min，然后浸入50%、70%、80%酒精中各1 min;（3）玻片浸入0.5%固綠染液1 min，然后100%酒精Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各10 s;（4）玻片按常規透明，中性樹膠封片。染色完成的軟骨玻片應用全自動病理掃描機（Vectra Polaris，美國PerkinElmer公司）進行掃描，得到的病理圖片根據Mankin評分[10]進行評分（輕度：1～4分;中度：5～9分;重度：10～13分），結果進行統計學分析。

1.5? 兔股骨內側髁軟骨黏彈性力學性能檢測

關節軟骨黏彈性力學性能檢測應用納米壓痕儀（Nano Indenter G200，美國Keysight公司）來完成。（1）試樣杯的制作簡要流程[7]：兔股骨截成長度（15±2） mm，清除關節多余組織，用浸潤生理鹽水的紗布包裹保濕;將攪拌均勻的樹脂倒入試樣杯[根據中國發明專利技術（CN201310477058.0）[11]標準進行制作;鋁試樣杯：高20 mm，外直徑為31 mm，內直徑為25 mm，孔高17 mm]至半杯左右，待樹脂黏稠難于攪動時，將股骨垂直插入樹脂，軟骨面朝上并保證被測軟骨區域與試樣杯口等高;加入生理鹽水至距離杯口約1 mm處，待測軟骨區域用濕潤紗布（生理鹽水）覆蓋;將制備完成的試樣杯置于通風廚中等待樹脂完全固化。試樣杯制備完成后裝入納米壓痕儀卡臺中完成測試。（2）納米壓痕實驗簡要步驟[7]：試樣杯固定于壓痕儀卡臺后，通過放大光學顯微鏡（250倍）確定需要壓入的軟骨位置（股骨內側髁）;輸入相關實驗參數：預壓深度10 μm，材料泊松比0.48，振動頻率為1～45 Hz，加載頻率數量5個，壓頭直徑70 μm，儀器自動完成測試。試驗中，機器判斷真實表面高度后，壓頭在被測區域位置預壓入10 μm，當漂移穩定、連續剛度測量組件穩定后，進行后續測量，得到5個頻率下（加載頻率分別為1、2.59、6.708、17.374、45 Hz）各自的阻尼系數和接觸剛度。將得出的儲存模量、損失模量及阻尼系數等數據進行統計學分析。

1.6? 統計學分析

采用SPSS 20.0軟件進行統計學分析，計量資料采用“x±s”表示。所有數據先進行Kolmogorov-Smirnov正態性檢驗、Levenes test方差齊性檢驗。符合正態分布及方差齊的數據資料采用單因素方差分析（one-way， ANOVA），各組間分析采用LSD中Dunnetts post hoc檢驗;不符合正態檢驗或方差不齊的數據，采用Kruskal-Wallis非參數秩和檢驗 。均以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1? 各組兔膝關節軟骨番紅O/固綠染色結果比較

空白組可見軟骨層均質紅染，軟骨4層結構清晰，軟骨層與軟骨下骨之間潮線清晰完整;模型組軟骨層淡染，軟骨4層結構分辨不清，潮線模糊，軟骨層厚度變薄;電針組及西藥組軟骨層結構紊亂，軟骨細胞不同程度增生，潮線層次不清或正常，軟骨層厚度變薄。對軟骨染色結果進行Mankin組織學評分定量分析后，與空白組相比，模型組Mankin評分顯著升高（P<0.01）;干預治療后與模型組相比，電針組Mankin評分顯著降低（P<0.01），西藥組Mankin評分明顯降低（P<0.05）。見表1、圖1。

2.2? 各組兔膝關節股骨軟骨納米壓痕結果比較

2.2.1? 各組兔膝關節股骨軟骨儲存模量結果比較? 從各頻率均值看，兔膝關節股骨軟骨在5個頻率下SM值隨著頻率增高而逐漸升高。與空白組相比，模型組股骨軟骨SM值表達顯著升高（P<0.01）;干預治療后與模型組相比，電針組、西藥組股骨軟骨SM值顯著降低（P<0.01）。從平均值看，模型組股骨SM值與空白組相比顯著升高（P<0.01）;干預治療后與模型組相比，電針組、西藥組股骨SM值顯著降低（P<0.01）。見表2。

2.2.2? 各組兔膝關節股骨軟骨損失模量結果比較? 從各頻率均值看，兔膝關節股骨軟骨在5個頻率下的損失模量LM值隨著頻率的增高先降低再逐漸升高。與空白組相比，模型組股骨軟骨LM值顯著升高（P<0.01）;干預治療后與模型組相比，電針組、西藥組股骨軟骨LM值顯著降低（P<0.01）。從平均值看，模型組股骨LM值與空白組相比顯著升高（P<0.01）;干預治療后與模型組相比，電針組、西藥組股骨LM值顯著降低（P<0.01）。見表3。

2.2.3? 各組兔膝關節股骨軟骨損失因子結果比較? 與空白組相比，模型組兔股骨軟骨LF值在1、2.59、6.708 Hz時表達升高，在17.374、45 Hz時，模型組股骨軟骨LF值表達降低，但差異均無統計學意義（P>0.05）;干預治療后與模型組相比，電針組和西藥組股骨軟骨LF值表達均有升高趨勢，但整體差異無統計學意義（P>0.05）。從平均值看，模型組脛骨LF值與空白組相比表達升高，但差異無統計學意義（P>0.05）;干預治療后與模型組相比，電針組、西藥組脛骨LF值表達升高，但差異均無統計學意義（P>0.05）。見表4。

3 討論

骨關節炎是骨骼肌肉系統中最常見的疾病，而各關節中最易受累的是膝關節[12]。導致KOA的高危因素眾多，包括中老年人、女性、肥胖、創傷以及過度使用關節的職業等[13]，深入分析可以發現一個共同的內在因素——膝關節異常的生物力環境：老年人及女性多存在膝周肌肉萎縮、肌肉無力等力學改變，肥胖患者膝關節長期承受過度的壓力負荷，關節過度使用的工種極大增加了膝關節的過度負荷。因此，有學者認為KOA是一種炎癥和生物力學共同作用導致的全關節疾病[2]，突出強調了生物力學在KOA致病的關鍵作用。在膝關節穩定的維持中，肌肉發揮動力性作用，既往研究證實了KOA患者多存在肌無力（如股四頭肌、腘繩肌[3]）的表現，且肌無力也會加速KOA疾病進展[14]。同時，研究還發現膝關節應力不足或過高均會導致軟骨組織退變破壞，而適度的力學環境促進軟骨細胞增殖及細胞外基質的合成[15]。因此，通過干預膝周肌肉組織，改善其萎縮狀態，調節關節軟骨異常生物力學環境是一種良好的治療策略。

關節軟骨微觀結構中，軟骨細胞鑲嵌于細胞外基質（extracellular matrix， ECM）組成的網狀結構中，ECM對軟骨細胞發揮支撐和保護作用，軟骨細胞、ECM共同構成了軟骨典型的4層結構，番紅O/固綠染色可以很好的區分軟骨和骨組織。本研究結果發現KOA兔制動4周后，模型組股骨內側髁軟骨組織Mankin病理評分與空白組相比顯著升高，達到輕、中度損傷程度。Ryuji Okazaki等[16]同樣應用制動法建立KOA兔模型，制動發現1～2周關節軟骨即出現早期退變，4周后中度退變，6周后嚴重退變，與我們的結果相似。干預治療后，電針組Mankin評分與模型組相比顯著降低，提示電針干預早期KOA兔模型對關節軟骨損傷具有保護作用。

軟骨組織具有獨特的力學性能，即黏彈性。這其中發揮力學作用的主要是軟骨ECM構成的獨特網狀結構，ECM主要由水、膠原蛋白、蛋白多糖等構成，其中最重要的結構是膠原蛋白，尤其是Ⅱ型膠原[17]。KOA的典型病理改變是軟骨細胞丟失及ECM的降解，ECM降解破壞是因，軟骨細胞失去支撐環境導致減少是果，并導致惡性循環。軟骨成分結構的改變，必然導致其生物力學性能的變化。本研究對關節軟骨進行納米壓痕儀檢測，相關指標主要為SM和LM。其中，SM又稱“楊氏模量”，反映了材料儲存彈性反沖能量的能力[18]：SM值越大，材料的剛度越大。

LM代表材料的能量耗損能力，是從能量損失角度來反映彈性模量[18]。SM/LM得出的值為損失因子（loss factor， LF），綜合反映材料的黏彈性能。本研究結果發現，SM值隨著頻率的增加而升高，這一表達趨勢與Lawless等[19]研究結果相似;而LM值、LF值隨著頻率的增加先降低再升高。整體數據來看：與空白組相比，模型組SM值、LM值顯著升高，提示股骨內側髁軟骨剛性顯著升高，意味著軟骨組織變硬;干預治療后與模型組相比，電針組和西藥組SM值、LM值顯著降低，說明電針、西藥可顯著改善股骨軟骨剛性;與空白組相比，模型組LF值表達升高，干預治療后與模型組相比，電針組和西藥組LF值表達升高，雖然差異均無統計學意義，但從一定角度反映了關節軟骨綜合黏彈性能的改變，有必要未來深入研究。Guilak等[20]研究發現，在犬早期骨關節炎（前交叉韌帶切斷）中關節軟骨抗拉剛度與正常軟骨相比降低，提示軟骨結構發生改變，同時進一步明確KOA軟骨膠原蛋白（減少36%）和蛋白多糖（減少37%）明顯減少，從另一角度解釋了KOA軟骨的微觀變化。

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