象皮生肌膏對慢性創面愈合及PTEN、p-AKT、VEGF蛋白表達的影響

姜雄　李木清　毛滔　劉梨　程學榮　楊振武　杜攀攀

〔摘要〕 目的 通過研究象皮生肌膏對大鼠慢性難愈性創面模型PTEN、p-AKT、VEGF蛋白表達的影響，探討象皮生肌膏促進創面愈合的作用機制。方法 從72只SD雄性大鼠中隨機選取18只為空白組，其余54只大鼠使用全層皮膚缺損法制備慢性難愈性創面模型，并隨機分為實驗組、對照組、模型組，每組18只。造模完成后實驗組予象皮生肌膏外敷，對照組予重組牛堿性成纖維細胞生長因子凝膠外敷，模型組和空白組予生理鹽水外涂，于造模后的第3、7、14天觀察創面愈合情況，計算創面愈合率，HE染色觀察皮膚組織形態，ELISA檢測各組皮膚組織PTEN、p-AKT、VEGF蛋白表達情況。結果 第3、7、14天實驗組、對照組創面愈合率均高于模型組（P<0.05），且第7天實驗組優于對照組（P<0.05）。HE染色結果顯示，空白組第3、7、14天皮膚組織完整，前后無明顯形態學變化;模型組第3、7天創面組織大量炎性細胞浸潤、表皮大量壞死脫落，第14天見少量毛細血管形成;實驗組及對照組第3天炎性細胞浸潤、表皮灶性壞死脫落，第7、14天炎性細胞浸潤逐漸減少、較多成纖維細胞和毛細血管增生、肉芽組織基本形成。第3、7、14天空白組PTEN、p-AKT、VEGF蛋白表達水平均無明顯差異（P>0.05）。第3、7、14天模型組PTEN蛋白表達水平均低于空白組（P<0.05），實驗組及對照組均低于模型組（P<0.05），且第7天達到最低水平（P<0.05）。第3、7、14天模型組p-AKT蛋白表達水平均高于空白組（P<0.05），實驗組及對照組均高于模型組（P<0.05），且第7天達到最高水平（P<0.05）。第3、7、14天模型組VEGF蛋白表達水平均低于空白組（P<0.05），實驗組及對照組均高于模型組（P<0.05），且第7天達到最高水平（P<0.05）。結論 象皮生肌膏能降低大鼠創面中PTEN蛋白表達水平、提高p-AKT、VEGF蛋白表達水平，加快慢性創面愈合速度，調控PTEN/AKT/VEGF信號通路可能是象皮生肌膏促進慢性創面愈合的機制之一。

〔關鍵詞〕 象皮生肌膏;慢性難愈性創面;PTEN;p-AKT;VEGF

〔中圖分類號〕R275.9? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.01.012

〔Abstract〕 Objective To study the effect of Xiangpi Shengji Ointment on PTEN， p-AKT and VEGF protein expression in rat chronic wound model， and to explore the mechanism of Xiangpi Shengji Ointment in promoting wound healing. Methods 18 SD male rats were randomly selected as the blank group， and the remaining 54 rats were made into chronic refractory wound model by full-thickness skin defect method， and were randomly divided into the experimental group， the control group and the model group， with 18 rats in each group. After modeling， the experimental group was externally applied with Xiangpi Shengji Ointment， the control group was externally applied with recombinant bovine basic fibroblast growth factor gel， and the model group and the blank group were externally coated with normal saline. The wound healing was observed on the 3rd， 7th and 14th day after modeling， the wound healing rate was calculated， the tissue morphology was observed by HE staining， and the expressions of PTEN， p-AKT and VEGF protein in skin tissue in each group were detected by ELISA. Results On the 3rd， 7th and 14th day， the wound healing rate of the experimental group and the control group was higher than the model group （P<0.05）， the experimental group was better than the control group on the 7th day （P<0.05）. The results of HE staining showed that on the 3rd， 7th and 14th day， the skin tissue in the blank group was intact， and there was no obvious morphological change before and after. In the model group， a large number of inflammatory cells infiltrated into the wound tissue on the 3rd and 7th day， a large number of epidermal necrosis and exfoliation， and a few capillaries formed on the 14th day; in the experimental group and the control group， inflammatory cells infiltrated， epidermal focal necrosis and exfoliationon the 3rd day， and inflammatory cells infiltration gradually decreased， with more fibroblasts and capillaries proliferating， and granulation tissue basically formed on the 7th and 14th day. The expression levels of PTEN， p-AKT and VEGF protein showed that there were no significant difference in the blank group on the 3rd， 7th and 14th day （P>0.05）. On the 3rd， 7th and 14th day， the level of PTEN proteinin the model group was lower than the blank group （P<0.05）， the experimental group and the control group were lower than the model group （P<0.05）， and reached the lowest level on the 7th day （P<0.05）. On the 3rd， 7th and 14th day， the level of p-AKT protein in the model group was higher than the blank group （P<0.05）， the experimental group and the control group were higher than the model group （P<0.05）， and reached the highest level on the 7th day （P<0.05）. On the 3rd， 7th and 14th day， the expressionof VEGF protein in the model group was lower than the blank group （P<0.05）， the experimental group and the control group was higher than the model group （P<0.05）， and reached the highest level on the 7th day （P<0.05）. Conclusion Xiangpi Shengji Ointment can reduce the expression level of PTEN protein， increase the expression levels of p-AKT and VEGF protein， and accelerate the speed of chronic wound healing. Regulating PTEN/AKT/VEGF signal pathway may be one of the mechanisms of Xiangpi Shengji Ointmentin promoting chronic wound healing.

〔Keywords〕 Xiangpi Shengji Ointment; chronic refractory wound; PTEN; p-AKT; VEGF

正常傷口愈合是止血、炎癥、增殖、重塑幾個連續且重疊的過程[1]，良好的循環在創面愈合過程中能保障新生組織充足養分，故血管新生是創面修復的重要條件[2]。近年來，PTEN/AKT/VEGF信號通路被證實參與創面的修復過程[3]，該通路的正向調節效能促進新生血管的生成，通過改善局部循環促進創面愈合。象皮生肌膏治療慢性難愈性創面歷史久遠，臨床療效可靠[4]，但象皮生肌膏促進慢性創面愈合的機制仍有待進一步研究。本實驗通過建立慢性難愈性創面大鼠模型，研究象皮生肌膏作用下創面PTEN、p-AKT、VEGF蛋白表達情況，進一步探討其促進慢性難愈性創面的作用機制，為臨床應用象皮生肌膏治療慢性難愈性創面提供可靠實驗依據。

1 材料與方法

1.1? 動物

SPF級SD大鼠72只，雄性，12周齡，220～250 g，由湖南中醫藥大學動物實驗中心[（動物使用許可證號：SYXK（湘）2019-0009）]代購于湖南長沙斯萊克景達實驗動物有限公司[（動物生產許可證號：SCXK（湘）2019-0004）]，所有實驗操作均遵循倫理標準，動物飼養于湖南中醫藥大學動物實驗中心，各組分籠飼養，自由飲水攝食，日溫差≤3 ℃，相對濕度40%～70%。

1.2? 藥物

象皮生肌膏（20200121，湖南中醫藥大學第一附屬醫院制劑室制備，湘藥制字Z20070276）。重組牛堿性成纖維細胞生長因子凝膠（04481212，珠海億盛生物制藥有限公司）。醋酸氫化可的松（S47632，上海源葉生物科技有限公司）。

1.3? 主要試劑與儀器

酶標儀（RT-6100，深圳雷杜生命科學股份有限公司）;988洗板機（Tianshi，北京拓普分析儀器有限責任公司）;PTEN（FY40152-A）、p-AKT（FY40155-A）、VEGF（FY3055-A）、酶聯免疫法檢測試劑盒（200717R39、200717R53、200718R55），均由江蘇菲亞生物有限公司提供。

1.4? 動物分組及模型制備

所有大鼠適應性喂養1周后隨機選取18只為空白組，空白組僅背部備皮處理。其余54只大鼠統一采用全層皮膚缺損法制備慢性難愈性創面[5]，先按照3 mL/kg標準腹腔注射10%水合氯醛將大鼠麻醉，確認麻醉充分后背部備皮，備皮面積約4 cm×4 cm，備皮完成后使用直徑為2 cm大小圓形印章在備皮區域進行標記，在嚴格無菌操作下延標記將大鼠全層表皮去除，深達筋膜層，按照80 mg/kg標準連續3 d每天注射1次醋酸氫化可的松，建成慢性創面模型，造模完成后將54只大鼠隨機分為實驗組、對照組、模型組，每組18只。

1.5? 動物用藥

實驗組和對照組用5%碘伏進行創面消毒，生理鹽水棉球擦凈后分別在創面涂抹約1 mm厚的象皮生肌膏或重組牛堿性成纖維細胞生長因子凝膠，使用無菌敷貼覆蓋創面;模型組創面消毒后外涂生理鹽水，使用無菌敷貼覆蓋創面;空白組僅在備皮處以生理鹽水外涂。造模結束后，各組每天早晚各換藥一次至實驗結束。

1.6? 標本取材與檢測

各組分別于第 3、7、14 天隨機選取6只大鼠，實驗組、對照組及模型組在創面去痂后從創面邊緣分離創面組織，取創面中肉芽組織，空白組取備皮處相同部位的正常皮膚組織。部分創面組織經液氮冷卻后放入-80 ℃冰箱凍存，部分創面組織固定于多聚甲醛中。

1.7? 創面愈合情況

于第 3、7、14天觀察并記錄各組創面愈合情況，用透明膜描記創面大小，將描記的透明膜放置小方格紙上計算創面面積，并計算每個時間點的創面愈合率[6]。

創面愈合率=（治療前面積-治療后面積）/治療前面積×100%

創面組織標本病理切片后進行HE染色，在顯微鏡下觀察各組大鼠創面組織的形態學變化。

1.8? ELISA檢測皮膚組織PTEN、p-AKT、VEGF蛋白表達水平

實驗結束后取組織進行勻漿后收集上清液，應用雙抗體夾心法測定標本中蛋白表達水平，具體步驟參考ELISA試劑盒說明。

1.9? 統計學方法

采用SPSS 25.0統計軟件進行數據分析，計量資料用“x±s”表示，滿足方差齊性檢驗者，采用單因素方差分析，再進行LSD組間兩兩比較，方差不齊時采用非參數秩和檢驗，再用Mann-Whitney U進行組間兩兩比較，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1? 各組愈合率比較

第3、7、14天實驗組、對照組創面愈合率均高于模型組，差異有統計學意義（P<0.05），第7天實驗組愈合率優于對照組，差異有統計學意義（P<0.05），第3、14天實驗組和對照組創面愈合率比較，差異無統計學意義（P>0.05），各組組內第3、7、14天創面愈合率整體均呈上升趨勢，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖1、表1。

2.2? 各組病理學變化情況比較

鏡下觀察可見，第3、7、14天空白組皮膚組織完整，前后無明顯形態學變化。第3天，模型組見創面組織大量炎性細胞浸潤，表皮大量壞死脫落，實驗組及對照組炎性細胞浸潤，表皮灶性壞死脫落。第7天模型組仍有大量炎性細胞浸潤，表皮壞死脫落，實驗組及對照組炎細胞浸潤減少，較多成纖維細胞和毛細血管增生。第14天仍有表皮壞死伴炎細胞浸潤，少量毛細血管形成，實驗組及對照組炎性細胞明顯減少，肉芽組織基本形成。見圖2。

2.3? 各組PTEN蛋白表達水平比較

第3、7、14天空白組PTEN蛋白表達水平前后比較無明顯差異（P>0.05），且均高于其他3組，差異有統計學意義（P<0.05）。第14天模型組PTEN蛋白表達水平低于第3、7天，差異有統計學意義（P<0.05）。第3、7、14天實驗組、對照組PTEN蛋白表達水平均低于模型組，且第7天表達為最低水平，差異有統計學意義（P<0.05）。第3、7、14天實驗組、對照組PTEN蛋白表達水平組間比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表2。

2.4? 各組p-AKT蛋白表達水平比較

第3、7、14天空白組p-AKT蛋白表達水平前后無明顯差異（P>0.05），且均低于其他3組，差異有統計學意義（P<0.05）。第3、7、14天模型組p-AKT蛋白表達水平呈上升趨勢，差異有統計學意義（P<0.05）。第3、7、14天實驗組、對照組p-AKT表達水平均高于模型組，且第7天達到最高水平，差異有統計學意義（P<0.05）。第3、7、14天實驗組、對照組p-AKT蛋白表達水平組間比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表3。

2.5? 各組VEGF蛋白表達水平比較

第3、7、14天空白組VEGF蛋白表達水平前后無明顯差異（P>0.05），且均高于其他3組，除外對照組第7天，余差異均有統計學意義（P<0.05）。第7、14天模型組VEGF蛋白表達水平高于第3天，差異有統計學意義（P<0.05）。第3、7、14天實驗組、對照組VEGF蛋白表達水平均高于模型組，且第7天達到最高水平，差異有統計學意義（P<0.05）。第7天實驗組VEGF蛋白表達水平高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。第3、14天實驗組、對照組VEGF蛋白表達水平組間比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表4。3 討論

慢性創面指在各種病因下通過1月以上治療仍未愈合，同時也無明顯愈合傾向，不能通過正常、有序、及時的修復達到解剖和功能完整的創面。本病中醫學屬于“潰瘍”“頑瘡”范疇[7]。象皮生肌膏出自《瘍科綱要》，作為祛腐生肌的代表藥物，治療創面愈合由來已久。象皮生肌膏藥以象皮止血、斂瘡為君藥，現代研究表明象皮具有保護創面、止血、抗炎的作用，能加速潰瘍肉芽組織生長，促進創面愈合[8];當歸補血活血、消腫止痛、排膿生肌為臣藥;《本草綱目》記載生地黃可填骨髓、長肌肉、生精血、通血脈;血余炭消瘀止血，石膏及爐甘石解毒、收濕、止癢、斂瘡、防腐生肌，佐以麻油滋潤潰面、解毒生肌。全方諸藥合用具有清熱活血、收濕斂瘡、祛腐生肌之效。近年來，大量研究[8-10]證明象皮生肌膏治療慢性創面療效可靠，具有較好的祛腐生肌、促進創面愈合的作用。

近年來，相關研究[3]表明PTEN/AKT/VEGF信號通路能夠有效參與創面修復的調控。PTEN在PTEN/AKT/VEGF信號通路中是負調控因子[11-12]，當上游的PTEN的含量降低時激活PI3K/Akt信號通路，PI3K表達隨之升高[13]，AKT表達水平增加[14]，AKT磷酸化后最終促進VEGF表達上調，誘導血管內皮細胞遷移、增殖和血管新生等[15-17]，加速創面愈合。大量研究[9，18]表明，象皮生肌膏可以提高創面組織中VEGF的含量，加速創面愈合，但作用機制仍有待進一步探討。

本研究結果顯示，實驗組及對照組在各個時間點創面愈合率均高于模型組，表明象皮生肌膏能有效促進慢性創面愈合;第3、7、14天，實驗組PTEN蛋白表達水平均較模型組降低（P<0.05），p-AKT、VEGF蛋白表達水平均較模型組升高（P<0.05），表明象皮生肌膏能降低PTEN蛋白表達水平，同時升高p-AKT、VEGF蛋白表達水平。在創面組織病理學變化的過程中，與同期模型組比較，實驗組及對照組組織病理學形態觀察，局部炎癥、肉芽組織情況明顯優于模型組。

綜上所述，本次研究結果提示象皮生肌膏能降低PTEN蛋白的表達，提高p-AKT、VEGF蛋白的表達，可能通過促進血管的生成而加快創面愈合，調控PTEN/AKT/VEGF信號通路可能是象皮生肌膏促進慢性創面大鼠模型加速愈合的作用機制之一。然而象皮生肌膏的作用機制復雜，在下一步工作中應進一步深入基因層面進行拓展研究。

參考文獻

[1] WANG P H， HUANG B S， HORNG H C，et al. Wound healing[J]. Journal of the Chinese Medical Association， 2018， 81（2）：94-101.

[2] AN Y， LIU W J， XUE P， et al. Autophagy promotes MSC-mediated vascularization in cutaneous wound healing via regulation of VEGF secretion[J]. Cell Death Discovery， 2018，9（2）：58-72.

[3] HAN Z F， CHEN Y， ZHANG Y L， et al. MiR-21/PTEN axis promotes skin wound healing by dendritic cells enhancement[J]. Journal of Cellular Biochemistry， 2017， 118（10）： 3511-3519.

[4] 謝先敏，王林華，謝心軍，等.脛骨橫向骨搬移技術聯合外用象皮生肌膏對糖尿病足兔潰瘍愈合影響的實驗觀察[J].湖南中醫藥大學學報，2020，40（1）：18-21.

[5] 趙京禹，付小兵，雷永紅，等.大鼠小面積全層皮膚缺損創面模型的制備[J].感染.炎癥.修復，2008，9（1）：64.

[6] 唐? 甜，楊? 靜.大黃素對家兔實驗性皮膚創傷的促愈合作用及其機制[J].中國藥理學與毒理學雜志，2006，20（2）：112-119.

[7] 劉? 東，伍光輝，羅? 琳，等.拔毒生肌散治療慢性創面的研究進展[J]. 世界中醫藥，2020，15（6）：949-952.

[8] 楊媚月，王小亮，劉清源，等.外用象皮生肌膏治療不可分期壓瘡的效果觀察[J].中醫藥導報，2016，22（3）：66-68.

[9] 羊? 羨，陳其華.托里消毒飲聯合象皮生肌膏治療慢性皮膚潰瘍的療效及對創面組織TNF-α、IL-6、VEGF表達的影響[J].湖南中醫藥大學學報，2019，39（4）：537-540.

[10] 謝佳楠，鄒曉玲.象皮生肌膏治療糖尿病足潰瘍41例臨床觀察[J]. 湖南中醫雜志，2018，34（6）：60-62.

[11] LU J M， ZHANG Z Z， MA X， et al. Repression of microRNA-21 inhibits retinal vascular endothelial cell growth and angiogenesis via PTEN dependent-PI3K/Akt/VEGF signaling pathway in diabetic retinopathy[J]. Experimental Eye Research， 2020， 190： 107886.

[12] ZHOU M， LI G B， ZHU L C， et al. Arctiin attenuates high glucose-induced human retinal capillary endothelial cell proliferation by regulating ROCK1/PTEN/PI3K/Akt/VEGF pathway in vitro[J]. Journal of Cellular and Molecular Medicine， 2020， 24（10）： 5695-5706.

[13] LI Z Q， XIE J T， FEI Y C， et al. GDNF family receptor alpha 2 promotes neuroblastoma cell proliferation by interacting with PTEN[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications， 2019， 510（3）： 339-344.

[14] OKUMURA N， YOSHIDA H， KITAGISHI Y， et al. PI3K/AKT/PTEN signaling as a molecular target in leukemia angiogenesis[J]. Advances in Hematology， 2012， 2012（5）： 1-6.

[15] TANAKA H， FUJITA N， TSURUO T. 3-phosphoinositide-dependent protein kinase-1-mediated IκB kinase β （IKKB） phosphorylation activates NF-κB signaling[J]. Journal of Biological Chemistry， 2005， 280（49）： 40965-40973.

[16] GORDAN J D， SIMON M C. Hypoxia-inducible factors： Central regulators of the tumor phenotype[J]. Current Opinion in Genetics & Development， 2007， 17（1）： 71-77.

[17] HAN Z F， CHEN Y， ZHANG Y L， et al. MiR-21/PTEN axis promotes skin wound healing by dendritic cells enhancement[J]. Journal of Cellular Biochemistry， 2017， 118（10）： 3511-3519.

[18] 馬? 樂，席建元，劉? 濤，等.象皮生肌膏治療慢性難愈性皮膚潰瘍[J].國際中醫中藥雜志，2019，41（2）：150-153.