寄生蜂轉錄組學研究進展

劉敏 劉愛萍 韓海斌

關鍵詞寄生蜂;轉錄組;研究進展

在所有昆蟲種類中，寄生性昆蟲約占20%左右，已知的寄生蜂種類超10萬種。寄生蜂分為外寄生和內寄生兩類，外寄生是指寄生蜂把卵產在寄主體表，幼蟲孵化后從體表攝取寄主營養;內寄生是把卵產在寄主體內，幼蟲孵化后取食寄主體內的組織。有些寄生蜂可以導致寄主種群大量個體死亡，因此應用寄生蜂來防治害蟲在實際生產中得到了廣泛應用。寄生蜂的應用價值使得人們不滿足于對其生物學特性的研究，而是研究越來越深入，逐漸轉向分子機理的研究。盡管新一代測序技術（next-generation sequencing，NGS）具有快速、高效、經濟等優點，但由于重視程度不夠，經費資助力度不足或其他原因，對于大多數生物而言，全基因組測序仍較為困難。為此，針對這些生物，研究人員提出了簡化基因組的測序策略。例如轉錄組測序成為研究基因表達的主要手段。轉錄組一般情況下指的是一定的生理狀態下，細胞中mRNA，rRNA，tRNA以及包括不編碼蛋白質的non-coding RNA在內的全部轉錄產物的集合，能夠反映生命體在不同生長發育階段、不同器官組織、不同生理生化狀態與不同生存環境下基因的表達模式。轉錄組是連接基因組遺傳信息與生物功能的蛋白質組的必然紐帶，轉錄水平的調控是目前研究最多的，也是生物體最重要的調控方式。對昆蟲進行轉錄組學研究，為研究人員對害蟲防治、藥物開發、疾病防治、昆蟲譜系地理學、生物進化等方面進行進一步研究提供了機會。如灰飛虱Laodelphax striatellus轉錄組信息揭示了其傳毒機制，煙粉虱Bemisia tabaci轉錄組圖譜為其抗藥性研究提供了依據。近些年來，生物防治領域越來越多地應用轉錄組測序去揭示寄生蜂與寄主問的互作機制。如，對于模式物種黑腹果蠅Drosophila melanogaster，鱗翅目害蟲小菜蛾Plu-tella xylostella、二化螟Chilo suppressalis，鞘翅目害蟲黃粉蟲Tenebrio molitor，半翅目害蟲煙粉虱Bemisia tabaci等害蟲，其寄生蜂調控機制的研究越來越廣泛、深入。

早期完成的寄生蜂基因組測序種類少，對寄生蜂基因家族的研究主要依賴于轉錄組數據，以此來完成對某個基因家族或者某一類基因家族的研究，如化學感受蛋白（chemosensory protein，CSPs），氣味結合蛋白（odorant binding protein，OBPs），氣味受體（olfactory receptor，ORs）等單個基因家族等。

目前國內外研究較多的是寄生蜂與其寄主的關系。寄生蜂能夠在寄主體內存活，必須克服寄主本身的免疫。基于組學的寄生蜂與寄主免疫的互作分析，是當前昆蟲免疫學研究的一個熱點。已有研究人員利用轉錄組學技術，從基因的整體表達水平上，闡述寄主感染寄生蜂后所引起的自身免疫系統激活特征。反顎繭蜂Asobara tabida寄生黑腹果蠅后，半閉彎尾姬蜂Diadegma semiclausum寄生小菜蛾后，蝶蛹金小蜂Pteromalus puparum寄生菜粉蝶Pieris rapae后，寄主免疫基因會出現差異表達。也有通過采用小范圍定向篩選基因的方法，鑒定果蠅參與應對匙胸癭蜂Leptopilina bou-lardi免疫反應的基因。

農業害蟲對農作物造成了巨大的損失，寄生蜂在害蟲生物防治中發揮了重要作用，其中繭蜂科Braconidae和小蜂總科Chalcidoidea是最主要的2個寄生農業害蟲的科，目前對寄生蜂的研究也主要集中在這2個科。寄生蜂與寄主昆蟲的相互作用主要體現在以下幾方面：首先，寄生蜂搜尋、定位寄主昆蟲的過程中，其化學感受基因起著重要作用。其次，在發現寄主后，寄生蜂將卵產于寄主體內，子代首先需要通過多種寄生因子克服寄主的免疫系統，并與寄主的免疫相關基因發生相互作用。第三，寄生蜂成功寄生于寄主體內后，對寄主生長發育產生的影響。另外，對寄生蜂滯育的研究，有利于擴繁寄生蜂，并延長產品的貨架期，更有利于寄生蜂的應用。本文主要對寄生蜂轉錄組的測序概況及在寄生蜂不同方面的研究應用進行總結和概括，以期為寄生蜂轉錄組的進一步研究和應用提供新思路。

1寄生蜂化學感受基因鑒定

在復雜的環境中，昆蟲需利用不同的感受模式（嗅覺、視覺、觸覺和聽覺）來精準定位寄主及配偶，在昆蟲的搜尋行為中，敏銳的化學感受系統是極其重要的工具。這個化學感受系統主要涉及氣味結合蛋白（OBPs）、嗅覺受體（ORs）、氣味降解酶（ODEs）等化學感受蛋白。研究發現，害蟲為害植物能夠刺激植物分泌揮發性信息物質，而這些物質又可以吸引寄生蜂等天敵來對付害蟲，進而發揮自然天敵的生防控害功能。寄生蜂體內的嗅覺相關蛋白在感知植物信號，發現、寄生和取食靶標害蟲這一系列活動中，都發揮其特有的功能。寄生蜂和寄主的關系與寄生蜂的實際應用密切相關，而化學感受基因是聯系兩者的關鍵，鑒定寄生蜂的化學感受基因是研究其功能的第一步，因此，對化學感受基因的鑒定十分必要。

化學感受基因僅在很少的寄生蜂物種中得到鑒定，包括菜蛾盤絨繭蜂Cotesia vestalis、中紅側溝繭蜂Microplitis mediator、腰帶長體繭蜂Macrocen-trus cingulum、班氏跳小蜂Aenasius bambawa-lei，這使得對其功能的研究受到一定的限制。廖成武根據已有的轉錄組數據鑒定出斑痣懸繭蜂Meteorus pulchricornis多種化學感受基因，利用轉錄組測序方法鑒定出斑痣懸繭蜂觸角和產卵器中的OBPs基因、CSPs基因、SNMPs基因、IRs基因、ORs基因等5種嗅覺相關基因，在觸角轉錄組鑒定出CX-Es基因和GSTs基因。Kang等通過轉錄組測序技術構建了煙蚜繭蜂Aphidius gi fuensis Ashmaed觸角轉錄組，并結合生物信息學分析鑒定出62個ORs基因、15個GRs基因和23個IRs基因。ORs在氣味和信息素的感受中具有重要作用。研究人員在斑痣懸繭蜂觸角轉錄組中鑒定出99個ORs基因，麗蠅蛹集金小蜂Nasonia vitripennis（Walker）觸角轉錄組中鑒定出301個ORs基因，腰帶長體繭蜂中鑒定出109個ORs基因，松褐天牛腫腿蜂Sclerodermus alternatusi Yang中鑒定出8個ORs基因。

4寄生蜂對寄主生長發育的調控作用

常見的寄生蜂調控寄主的途徑包括發育歷期、激素水平、蛋白質分泌以及神經信號傳遞等生理過程。抑制寄主發育或促進寄主早熟變態是主要的調控方式。但任何一種方式的最終目的都是使寄生蜂和寄主保持同步發育。有研究表明，寄生蜂能夠調節改造被寄生的蚜蟲的生理、代謝、生物合成、免疫功能，使得蚜蟲體內環境適合于寄生蜂的生長發育。

Zhang等研究發現，被寄生蜂寄生的棉蚜Aphis gossypii Glover與未被寄生的棉蚜相比，幾乎所有與甘油酸三酯合成相關的基因都發生了上調表達，多數達到顯著上調水平，進一步證明了寄生蜂可調節寄主脂質合成這一結論。高雪珂對被棉蚜繭蜂寄生的棉蚜進行轉錄組測序，重點分析了甘油磷脂、鞘磷脂及甘油脂質代謝途徑和脂肪酸合成途徑。研究結果表明，在被寄生的棉蚜體內，這些途徑中關鍵基因顯著上調表達，Goan增加7.8倍，溶血磷脂合成基因（Agpat3、Cdsl、Lpgatl、Pgs1和Pla2g2e）表達量顯著上升。溶血磷脂具有神經毒性作用，低劑量時可使細胞溶解。棉蚜繭蜂通過調節棉蚜生理環境，促進寄生蜂利用寄主營養物質。有研究報道，在被寄生蜂寄生的蚜蟲體內，糖酵解途徑中所有脂代謝相關基因均顯著上調表達。此外，寄生作用還能促進寄主糖酵解和三羧酸循環。結合轉錄組信息，發現棉蚜被棉蚜繭蜂寄生后，脂肪酸合成通路相關基因被激活。

芳基貯存蛋白（arylphorin）是昆蟲變態過程中的貯存蛋白，主要在末齡幼蟲期大量合成。研究表明，煙芽夜蛾Heliothis virescens幼蟲被藏紅足側溝繭蜂Microplitis croceipes寄生后芳基貯存蛋白轉錄水平顯著降低，發育延緩。

5寄生蜂滯育的研究

昆蟲在滯育期問特異性表達，而在非滯育階段不表達或表達極微量的一類蛋白質，如貯藏蛋白、抗凍蛋白、熱休克蛋白、分子伴侶及酶等，被稱為滯育關聯蛋白，它們在滯育昆蟲的能量代謝、表皮黑化、脂肪積累、免疫調節等生命活動中發揮重要作用。在對滯育關聯蛋白進行研究的同時，也逐漸開始應用轉錄組測序技術探索編碼蛋白的基因以及小型寄生蜂的滯育遺傳機制。在生物防治領域中，天敵昆蟲的滯育是大規模人工擴繁天敵昆蟲一個重要的實踐問題。一方面，天敵昆蟲存活期較短，擴繁周期較長，導致天敵在害蟲發生前就已死亡，或害蟲發生時沒有天敵可用;另一方面，人工擴繁的天敵昆蟲在低溫下儲存的有效儲存時問較短，而將人工擴繁的天敵昆蟲以滯育狀態進行儲存，在田問釋放前再解除滯育，不影響其生命力且存活率高。因此，通過對天敵昆蟲的滯育研究，可達到調控天敵昆蟲生長發育、延長儲存期、提高抗逆性等目的。目前對于天敵昆蟲的滯育誘導主要是通過溫度和光照條件的共同作用，誘導蟲體進入滯育，但這樣的方法耗時長，效率低，不利于大規模擴繁天敵昆蟲。通過轉錄組測序，從滯育的分子機理人手，通過分析滯育相關的基因，可以為滯育誘導提供一種新的思路，從而更好地應用天敵控制害蟲。

2014年Chen等對編碼麥蛾柔繭蜂Habrobra-COn hebetor Say熱休克蛋白Hsp70的3個基因（HhHsp70Ⅰ、HhHsp70Ⅱ及HhHsp70Ⅲ）進行了測序并對它們的表達特征進行研究，結果發現當飼養條件改變時3個基因的表達量的變化不完全相同。通過RNA干擾技術干擾麗蠅蛹集金小蜂的生物鐘基因period，發現短光照不能誘導小蜂滯育，但低溫仍然可以誘導小蜂進入滯育狀態，由此可以推測生物鐘基因period不直接決定麗蠅蛹集金小蜂滯育，而是影響其對光周期的感應。2017年，安濤等對煙蚜繭蜂正常發育、滯育、滯育解除組樣本進行De novo雙端測序，根據測序結果，共獲取40 477個unigene，非滯育組與滯育組差異表達基因458個，滯育組與滯育解除組差異表達基因298個，進一步篩選出滯育組與非滯育組及滯育解除組差異顯著、但非滯育組與滯育解除組無顯著差異的滯育關聯基因59個，對這59個滯育關聯基因進行GO富集分析與KEGG通路表達分析，根據功能注釋發現這些滯育關聯基因與煙蚜繭蜂自身防御、耐寒性、脂類代謝、表皮黑化、轉錄調控等途徑相關，是影響煙蚜繭蜂滯育進程的重要調控和參與基因。

6寄生蜂寄生后寄主神經肽的研究

對寄生蜂寄生后寄主神經肽的研究，其實是研究寄生蜂對寄主發育調控的影響。在昆蟲所有的器官中幾乎都有神經肽參與作用，調控器官狀態和影響它們的功能。在昆蟲生長和發育的許多方面，都有神經肽的參與，調控昆蟲的生理活動，比如促前胸腺激素（prothoracicotropic hormone，PTTH）和鞣化激素（bursicon）等與昆蟲的蛻皮行為有關，neuropeptide F（NPF）和short neuropeptideF（sNPF）等可對昆蟲的覓食和取食行為起到調節作用等。董帥應用Illumina測序技術對被菜蛾盤絨繭蜂寄生的小菜蛾腦組織進行轉錄組測序，拼接后得到42 441個unigene序列。基于轉錄組測序結果的物種分布發現，同源序列主要集中在已完成基因組測序且生物信息學較為成熟的物種。根據小菜蛾腦組織轉錄組Nr注釋結果，找到19種神經肽基因的同源序列，通過反轉錄驗證了其中6個神經肽基因的存在，包括A型咽側體抑制肽AstA、咽側體活化肽AT、鞣化激素BUR及PBUR，促前胸腺激素PTTH和類甲殼心律肽CCAP。

小菜蛾幼蟲被菜蛾盤絨繭蜂寄生與假寄生后，對其神經肽基因轉錄趨勢進行研究發現，神經肽基因的轉錄規律與小菜蛾幼蟲不同齡期的蛻皮活動相關。小菜蛾被菜蛾盤絨繭蜂寄生后的神經肽轉錄水平可以分為轉錄水平下調型和轉錄水平上調型。小菜蛾被假寄生后的神經肽分為轉錄水平平穩型和轉錄水平波動型。通過對未寄生、寄生與假寄生的轉錄水平規律比較發現，小菜蛾幼蟲被菜蛾盤絨繭蜂寄生或假寄生后，某些神經肽基因轉錄受到影響，且轉錄峰出現的時問被推遲，但是轉錄趨勢不變。

7展望

轉錄組學技術的應用，對深入了解寄生蜂生物學現象、生理過程、寄生后寄主發育趨勢的預測等有著至關重要的作用，這些理論基礎的掌握，可以幫助我們更好、更高效地利用寄生蜂控制害蟲。基于當前寄生蜂轉錄組的研究現狀，結合國內外昆蟲領域的研究熱點以及應用寄生蜂防控農林害蟲的需求，本研究提出2個關于寄生蜂轉錄組在未來研究中應重視的方面，以期對寄生蜂轉錄組的研究與應用提供思路。

一是加強寄生蜂轉錄組、蛋白質組、代謝組等多組學結合的研究。目前多組學結合對昆蟲進行研究已經有了較廣泛的應用。2017年，Zhao等通過對二斑葉螨Tetranychus urticae滯育與非滯育成蟲轉錄組與蛋白質組聯合分析，確定了ca信號通路在其滯育調控中的實際作用;2016年，Qiu等對褐飛虱Nilaparvata lugens進行了轉錄組和蛋白質組聯合分析，研究了與繁殖力相關基因的功能，為褐飛虱的防治提供了參考靶標基因。在寄生蜂的研究中，目前只有轉錄組與蛋白組聯合分析揭示煙蚜繭蜂的滯育機制。應用多組學聯合分析將更有利于對寄生蜂分子機制的研究。

二是探索針對寄生蜂的第3代測序技術應用研究。第2代測序技術衍生出的轉錄組測序技術被廣泛應用于分子機理的研究，目前一種新型測序技術一第3代測序技術的出現又為基因組學、轉錄組學及DNA甲基化等研究注入了新活力。第3代測序技術已經在轉錄組測序中成功應用于人類造血組細胞中的巨核細胞以及一些蘑菇狀真菌種類中，但尚未見到第3代測序技術在寄生蜂轉錄組中的應用。第3代測序技術相較第2代測序技術具有通量更高、速度更快、讀長更長、假陽性率更低等諸多優點，在未來寄生蜂研究中有著巨大的發展潛力。