FK506結(jié)合蛋白FKBP52對(duì)金龜子綠僵菌侵染東亞飛蝗的影響

田野 李貝貝 李霜 農(nóng)向群 張澤華 劉廷輝 王廣君

關(guān)鍵詞東亞飛蝗;FK506結(jié)合蛋白;金龜子綠僵菌;保護(hù)酶

FK506結(jié)合蛋白（FK506 binding proteins，F(xiàn)K-BPs）是一類(lèi)以胞內(nèi)蛋白為主的蛋白質(zhì)超家族，因其與FKS06（Prograf，普樂(lè)可復(fù)）的相互作用而得名，它具有肽基脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶（PPIases）活性，可催化多肽或蛋白質(zhì)底物中的肽一脯氨酸順?lè)醋拥霓D(zhuǎn)換，從而影響其活性、磷酸化狀態(tài)、蛋白質(zhì)間相互作用、亞細(xì)胞定位及穩(wěn)定性。FKBPs能夠結(jié)合環(huán)孢素a（CsA）、FKS06或雷帕霉素，發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)。在免疫細(xì)胞中，F(xiàn)KBPs和FKS06的二元復(fù)合體共同作用，抑制鈣調(diào)磷酸酶（CAN）的活性，進(jìn)一步作用于磷酸化信號(hào)途徑，使免疫細(xì)胞產(chǎn)生免疫抑制作用。此外，F(xiàn)KS06結(jié)合蛋白還有許多其他重要生理功能，如細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、鈣離子通道活性調(diào)節(jié)以及發(fā)育調(diào)節(jié)等作用。

金龜子綠僵菌Metarhizium anisopliae作為一類(lèi)廣譜性的昆蟲(chóng)病原真菌，對(duì)害蟲(chóng)生物防治具有重要作用。其侵染方式主要有體壁侵入和體內(nèi)增殖兩種。其中體壁侵染機(jī)制是金龜子綠僵菌孢子附著在寄主體表后，形成附著胞和侵染釘，在一系列胞外酶的作用下，穿透體壁進(jìn)人體腔，形成蟲(chóng)菌體，大量繁殖，消耗寄主營(yíng)養(yǎng)，并分泌多種毒素，最終造成寄主死亡。研究發(fā)現(xiàn)，采用金龜子綠僵菌制劑可以有效控制蝗蟲(chóng)為害，但與化學(xué)農(nóng)藥相比，存在致死效率低、致死時(shí)間長(zhǎng)的弊端。其原因一方面是金龜子綠僵菌侵染所需時(shí)間較長(zhǎng)，另一方面是東亞飛蝗具有較強(qiáng)的免疫防御反應(yīng)。因此，我們推測(cè)可以通過(guò)改變蝗蟲(chóng)體內(nèi)FKBPs的量，抑制東亞飛蝗免疫活性，促進(jìn)金龜子綠僵菌侵染，達(dá)到加速蝗蟲(chóng)死亡的目的。

本試驗(yàn)通過(guò)定量PCR檢測(cè)了FKBP52基因在東亞飛蝗不同組織中的表達(dá)情況，克隆了FKBP52基因，并獲得了FKBP52蛋白，研究了其對(duì)金龜子綠僵菌侵染東亞飛蝗的影響，以及對(duì)東亞飛蝗體內(nèi)免疫相關(guān)酶的誘導(dǎo)激活作用，為進(jìn)一步明確FKBP的功能奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)對(duì)指導(dǎo)蝗蟲(chóng)防治具有一定的理論意義。

1材料與方法

1.1供試菌株、試蟲(chóng)與試劑

供試金龜子綠僵菌菌株IMl330189為國(guó)外引進(jìn)在本實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期保藏。培養(yǎng)條件：將菌株接種到PDAY培養(yǎng)基（馬鈴薯200g，蔗糖20g，酵母粉5g，瓊脂粉20g，補(bǔ)水定容至1000mL，121℃高壓滅菌25min）平板上，25℃下培養(yǎng)5d。收集分生孢子粉，密封貯存于4℃冰箱，備用。

試驗(yàn)所用東亞飛蝗Locusta migratoria ma-nilensis為本實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)純化種群，在人工氣候培養(yǎng)箱中于溫度（30±2）℃，相對(duì)濕度（60±5）%，光周期L∥D=14h∥10h條件下孵化后，將同一時(shí)問(wèn)孵化的蝗蝻轉(zhuǎn)移到60cm×50cm×70cm規(guī)格的養(yǎng)蟲(chóng)籠中飼養(yǎng)，光周期L∥D=14h∥10h，溫度為（30±2）℃。

試劑TRIzol、PrimeScriptTM RT Reagent Kitwith gDNA Eraser、LA-Taq酶、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和HindⅢ、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（TliRNaseH Plus）、無(wú)RNase純水等均購(gòu)于TaKaRa公司;感受態(tài)細(xì)胞BL21（DE3）、蛋白Marker和Ni-NTA親和層析柱購(gòu)自北京全式金生物有限公司;大腸桿菌Escherichia coli DH5a和載體pET-21b為本實(shí)驗(yàn)室保存;膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自北京天漠科技開(kāi)發(fā)有限公司;超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所;引物合成和測(cè)序由上海生工生物工程股份有限公司完成。

1.2東亞飛蝗總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄

用TRIzol溶液提取東亞飛蝗成蟲(chóng)后足、體壁、脂肪體和血淋巴等不同組織、卵塊、1齡蝗蝻蟲(chóng)體、2～5齡蝗蝻及雌雄成蟲(chóng)中腸的RNA，并用NanoPhotometer微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度和純度，按照PrimeScriptTM RT Reagent Kit with gD-NA Eraser說(shuō)明書(shū)方法合成cDNA第1鏈，直接進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)或者-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 FKBP52基因在飛蝗成蟲(chóng)不同組織、不同發(fā)育階段中腸中的表達(dá)

基于NCBI中已經(jīng)公布的昆蟲(chóng)FKBP基因序列，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室前期測(cè)得東亞飛蝗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，獲得FKBP52基因的DNA序列;利用DNAMAN6.0軟件設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物及基因克隆所需引物（表1），由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.4東亞飛蝗FKBP52基因克隆

以1.2中合成的成蟲(chóng)時(shí)期東亞飛蝗cDNA作為模板，F(xiàn)KBP52-F、FKBP52-R為引物，PCR擴(kuò)增FKBP52基因。反應(yīng)體系（25μL）：10×PCRBuffer 2.5μL，dNTPs 2μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，上下游引物（10 gmol/L）各1μL，cDNA1μL，雙蒸水17μL。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min;94℃變性1min，58℃退火1min，72℃延伸90 s，共30個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min;4℃保存。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，目的條帶切膠回收。將純化產(chǎn)物連接到pMD19-T載體。采用熱激轉(zhuǎn)化法，導(dǎo)人感受態(tài)細(xì)胞DH5a中;通過(guò)氨芐抗性篩選陽(yáng)性克隆。將篩選到的陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR檢測(cè)，正確的送公司測(cè)序。從篩選獲得的目標(biāo)菌株中提取質(zhì)粒，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5生物信息學(xué)分析

目的基因核酸序列的翻譯以及編碼蛋白質(zhì)序列結(jié)構(gòu)分析預(yù)測(cè)采用DNAMAN軟件;蛋白質(zhì)分子量預(yù)測(cè)采用https：//web.expasy.org/cgi-bin/prot-param/protparam在線工具;利用SignalP在線軟件信號(hào)肽。利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中BlastP（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行氨基酸序列同源性分析，運(yùn)用在線軟件SMART（http：//smart.emblheidelberg.de/smart/set）分析保守結(jié)構(gòu)域。

1.6 FKBPS2蛋白表達(dá)與純化

從測(cè)序正確的轉(zhuǎn)化子中提取質(zhì)粒，以該質(zhì)粒為模板，用分別帶有EcoR工和HindⅢ酶切位點(diǎn)的引物FKBP52-F/FKBP52-R進(jìn)行PCR，擴(kuò)增FKBP52全長(zhǎng)基因。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)無(wú)誤后，使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收，用EcoRⅠ和HindⅢ進(jìn)行雙酶切。將酶切產(chǎn)物回收，與pET-21b載體進(jìn)行連接，構(gòu)建重組表達(dá)載體。采用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21，涂板、挑單克隆檢測(cè)。將陽(yáng)性克隆在LB（Amp）液體培養(yǎng)基中37IC培養(yǎng)至為0.5～0.6時(shí)，加入IPTG，至終濃度為0.5 mmol/L，16℃進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)12h。離心收集菌體，超聲波破碎（300w，超聲持續(xù)5s，暫停5s，重復(fù)99個(gè)循環(huán)）后，4℃，9000r/min離心10min，取上清。用鎳柱親和層析進(jìn)行蛋白純化，用SDS-PAGE電泳檢測(cè)所純化蛋白濃度。

1.7金龜子綠僵菌與FKBPS2組合對(duì)東亞飛蝗生物活性測(cè)定

采用金龜子綠僵菌IMI330189孢子懸浮液?jiǎn)未伪嘲妩c(diǎn)滴和FKBP52蛋白飼喂3齡東亞飛蝗的方法來(lái)測(cè)定FKBP52對(duì)金龜子綠僵菌的毒力影響，稱(chēng)取0.5g金龜子綠僵菌孢子粉于0.05%的吐溫80溶液中，用渦旋儀使其混合均勻，隨后用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，配制成終濃度為4.15×10個(gè)/mL的金龜子綠僵菌孢子懸浮液。FKBP52蛋白測(cè)定濃度后，配制成終濃度為1mg/mL的蛋白液。共設(shè)3個(gè)處理1個(gè)對(duì)照。

處理1：金龜子綠僵菌孢子懸浮液背板點(diǎn)滴，餌劑為1g含5%植物油的無(wú)菌麥麩;處理2：FKBP52蛋白飼喂，餌劑為1g含5%植物油的無(wú)菌麥麩+1mL的FKBP52蛋白;處理3：同時(shí)進(jìn)行金龜子綠僵菌孢子懸浮液背板點(diǎn)滴和FKBP52蛋白飼喂，餌劑為1g含5%植物油的無(wú)菌麥麩+1mL的FKBP52蛋白;對(duì)照：同時(shí)進(jìn)行0.05%的吐溫80溶液背板點(diǎn)滴和大腸桿菌BL21（DE3）（含有pET-21b空載體）誘導(dǎo)表達(dá)的菌體飼喂，餌劑為1g含5%植物油的無(wú)菌麥麩+1mL終濃度為1mg/mL的空載體誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白。不同處理中金龜子綠僵菌孢子用量和FKBP52蛋白濃度見(jiàn)表2。對(duì)照和所有處理均重復(fù)5次。

將預(yù)先饑餓處理12h的3齡東亞飛蝗蝗蝻按照30頭/筐的標(biāo)準(zhǔn)放人無(wú)菌的塑料生測(cè)筐中（長(zhǎng)×寬×高=30 cmX12 cmX9cm），用已消毒的玻璃板蓋好。金龜子綠僵菌單獨(dú)處理和金龜子綠僵菌+FKBP52共同處理中的蝗蝻全部以背板點(diǎn)滴的方式接種金龜子綠僵菌IMI330189孢子懸浮液（濃度為4.15×10個(gè)/mL），對(duì)照組中的蝗蝻全部以背板點(diǎn)滴的方式接種0.05%的吐溫80溶液，每頭蝗蝻接種量為2μL。對(duì)照、FKBP52、綠僵菌單獨(dú)處理以及金龜子綠僵菌+FKBP52共同處理中分別加入相應(yīng)的餌劑。根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，24h后將餌劑取出，以新鮮麥苗飼喂至試驗(yàn)結(jié)束，每日記錄蝗蟲(chóng)的死亡數(shù)與存活數(shù)，連續(xù)統(tǒng)計(jì)10d。試驗(yàn)于溫度30℃，相對(duì)濕度60%，光周期L//D=16h//8h生測(cè)室內(nèi)進(jìn)行。

1.8 FKBP52處理后東亞飛蝗保護(hù)酶酶活力測(cè)定

按照與1.7相同的方法處理蝗蝻，將3齡蝗蝻分裝，每筐15頭，每個(gè)處理重復(fù)3次。第2天開(kāi)始，從每個(gè)處理的3個(gè)重復(fù)中各取1頭蝗蟲(chóng)，解剖收集中腸，于液氮中研磨，加入預(yù)冷的20mmol/L Tris-HCl緩沖液，4℃、15000r/min離心20min，取上清作為酶提取液，以牛血清蛋白BSA為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，參照Bradford方法測(cè)定每個(gè)提取液的蛋白濃度，然后測(cè)定酶液中過(guò)氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）的活性，具體測(cè)定方法參照試劑盒使用說(shuō)明書(shū)。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。

1.9數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS19軟件進(jìn)行單因素方差分析，并選用多重比較進(jìn)行顯著性差異分析，其中P<0.05表示樣本問(wèn)存在顯著差異，P%0.01表示樣本間存在極顯著差異。

2結(jié)果與分析

2.1 FKBP52在飛蝗成蟲(chóng)不同組織中和不同發(fā)育時(shí)期中腸中的表達(dá)分析

研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)KBP52基因在雌、雄成蟲(chóng)的體壁、血淋巴、脂肪體、足、中腸、精巢和卵巢中都有表達(dá)，其中在雄成蟲(chóng)中腸內(nèi)的表達(dá)量最高。以FKBP52基因在雄性成蟲(chóng)體壁中的表達(dá)量為標(biāo)準(zhǔn)參量，雄成蟲(chóng)中腸中FKBP52基因的表達(dá)量為體壁中表達(dá)量的4.13倍;其次為雌成蟲(chóng)中腸，相對(duì)表達(dá)量是雄成蟲(chóng)體壁中表達(dá)量的3.41倍;但雌、雄成蟲(chóng)中腸的相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著性差異（P>0.05）。FKBP52基因在雌、雄成蟲(chóng)脂肪體中的相對(duì)表達(dá)量也較高，分別為雄成蟲(chóng)體壁表達(dá)量的2.79倍和2.71倍，二者之間也無(wú)顯著性差異（P>0.05）。FKBP52基因在雌、雄成蟲(chóng)足中的表達(dá)量分別為雄成蟲(chóng)體壁表達(dá)量的1.38倍和1.60倍（P>0.05）。在雌蟲(chóng)體壁中的表達(dá)量與雄蟲(chóng)體壁之間無(wú)顯著差異。但是在雄性精巢和雌性卵巢中的表達(dá)量略低于雄蟲(chóng)體壁。FKBP52基因在雌、雄成蟲(chóng)血淋巴中的表達(dá)量相對(duì)較少，分別為雄成蟲(chóng)體壁表達(dá)量的0.77倍和0.38倍（P>0.05）（圖1）。

FKBP52基因在卵塊、1齡蝗蝻蟲(chóng)體、2～5齡蝗蝻及雌、雄成蟲(chóng)中腸中都有表達(dá)，其中卵塊中表達(dá)量最高。以FKBP52基因在1齡蝗蝻中的表達(dá)量為標(biāo)準(zhǔn)參量，卵塊中FKBP52基因的表達(dá)量為1齡蝗蝻表達(dá)量的3.89倍，顯著高于其他齡期（P<0.05）。其次為雌、雄成蟲(chóng)中腸，F(xiàn)KBP52基因的表達(dá)量為1齡蝗蝻表達(dá)量的3.09倍和2.91倍，二者之間無(wú)顯著性差異（P>0.05）;3齡蝗蝻中腸、2齡蝗蝻中腸、5齡蝗蝻中腸、4齡蝗蝻中腸的表達(dá)量依次遞減，F(xiàn)KBP52基因的表達(dá)量分別為1齡蝗蝻表達(dá)量的0.99，0.81，0.46和0.26倍?？梢?jiàn)，不同發(fā)育期的轉(zhuǎn)錄水平中，該基因主要在東亞飛蝗卵和雌雄成蟲(chóng)中腸中表達(dá)（圖2）。

2.2東亞飛蝗FKBP52基因的克隆

通過(guò)PCR擴(kuò)增得到FKBP全長(zhǎng)基因。將其連接到pMD19-T克隆載體中，導(dǎo)人大腸桿菌DH5a中，經(jīng)抗性篩選獲得陽(yáng)性克隆，進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果表明，該基因長(zhǎng)度為1242bp（圖3），編碼413個(gè)氨基酸，通過(guò)NCBI序列比對(duì)，將其命名為FKBP52。利用SMART的序列工具分析FKBP52氨基酸序列，結(jié)果顯示FK-BP52蛋白在第38-130位氨基酸、158-247位氨基酸之間存在2個(gè)FKBP_C超家族保守結(jié)構(gòu)域，屬于FKBP_C超家族成員之一（圖4下劃線所注）。

2.3 FKBP52蛋白表達(dá)與純化

將FKBP52基因插入表達(dá)載體pET-21b中獲得重組表達(dá)載體pET21b-FKBP52，將其導(dǎo)人大腸桿菌BL21后，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，獲得目的蛋白FKBP52。經(jīng)過(guò)15%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)分析，蛋白大小為46 kDa，與預(yù)期大小相符。大量提取蛋白，經(jīng)鎳柱親和層析純化，得到FKBP52純蛋白（圖5）。

2.4 FKBP52蛋白對(duì)金龜子綠僵菌侵染東亞飛蝗的影響

研究發(fā)現(xiàn)，使用只含F(xiàn)KBP52蛋白的餌劑處理東亞飛蝗，到第10天其累計(jì)平均死亡率為2.22%，與對(duì)照組（1.11%）無(wú)顯著差異（P>0.05）。單獨(dú)使用金龜子綠僵菌處理時(shí)，東亞飛蝗累計(jì)死亡率隨處理天數(shù)增加不斷上升，第10天達(dá)到60%，顯著高于FKBP52蛋白單獨(dú)處理組和對(duì)照組。使用金龜子綠僵菌與FKBP52蛋白同時(shí)處理東亞飛蝗時(shí)，在二者的共同作用下，東亞飛蝗的累計(jì)死亡率迅速上升，到第10天達(dá)到93.33%，顯著高于金龜子綠僵菌單獨(dú)處理組（P<0.05）（圖6，表3）。上述結(jié)果表明FK-BP52蛋白與金龜子綠僵菌共同處理，可以顯著提升對(duì)東亞飛蝗的致病力，提高殺蟲(chóng)效果。

2.5 FKBP52蛋白對(duì)東亞飛蝗過(guò)氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）酶活力的影響

研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)KBP52單獨(dú)處理東亞飛蝗時(shí)，第1、4、5天POD酶活力與對(duì)照組之問(wèn)無(wú)顯著性差異（P>0.05），第2、3天時(shí)POD活力顯著低于對(duì)照組（P<0.05）。金龜子綠僵菌單獨(dú)處理時(shí)，在第3天和第5天東亞飛蝗的POD酶活力顯著高于對(duì)照，尤其是第3天時(shí)，POD活力達(dá)到最高值11.609 u/mg;但在第2天POD的酶活力低于對(duì)照;在第1、4天其酶活力與對(duì)照無(wú)顯著差異。FKBP52與金龜子綠僵菌共同處理時(shí)，除第1天外（第1天處理組的POD酶活力與其他處理無(wú)顯著差異），第2、3、4、5天，處理組的POD活性都顯著低于對(duì)照組（P<0.05），同時(shí)在第3-5天，F(xiàn)KBP52與金龜子綠僵菌共同處理組POD活性顯著低于金龜子綠僵菌單獨(dú)處理組（P<0.05）（圖7）。

FKBP52單獨(dú)處理東亞飛蝗時(shí)，第3、4、5天，處理組的SOD酶活力達(dá)到10.502、8.644、9.182 u/mg，顯著高于對(duì)照組（分別為8.478、7.729、7.662 U/mg）（P<0.05），但在第1、2天時(shí)，與對(duì)照組之間都無(wú)顯著性差異（P>0.05）。金龜子綠僵菌單獨(dú)處理時(shí)，在第3天和第5天東亞飛蝗的SOD酶活力顯著高于對(duì)照，尤其是第3天時(shí)，SOD酶活力達(dá)到最高值10.769u/mg;在第1天和第4天，SOD酶活力與對(duì)照無(wú)顯著差異（P>0.05）;但在第2天，處理組的酶活力顯著低于對(duì)照組（P<0.05）。FKBP52與金龜子綠僵菌共同處理時(shí)，在第1天，處理組SOD酶活力與對(duì)照組之問(wèn)無(wú)顯著性差異;但第3、4、5天，處理組的SOD活性顯著低于對(duì)照組和金龜子綠僵菌單獨(dú)處理組（P<0.05），且從第1天開(kāi)始呈現(xiàn)持續(xù)降低的趨勢(shì)（圖8）。

3討論

昆蟲(chóng)在長(zhǎng)期進(jìn)化中形成了一套獨(dú)特的免疫系統(tǒng)使其能夠抵御逆境，擴(kuò)大分布，并抵抗病原微生物的侵入。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，關(guān)于昆蟲(chóng)免疫的主要過(guò)程及分子機(jī)理逐漸清晰，昆蟲(chóng)免疫機(jī)制的研究成果對(duì)于研究飛蝗免疫反應(yīng)機(jī)制具有重要的參考意義。FKS06結(jié)合蛋白（FKBP）作為一種免疫調(diào)節(jié)蛋白，還參與了生物體內(nèi)眾多重要生理反應(yīng)，如細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)、鈣離子通道活性的調(diào)節(jié)以及生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)節(jié)等。如朱佳證實(shí)了FKS06結(jié)合蛋白與棉鈴蟲(chóng)Helicoverpa armigera滯育有關(guān)。Li等研究表明FK506結(jié)合蛋白在家蠶Bombyx mori每個(gè)發(fā)育階段（卵、幼蟲(chóng)、蛹、成蟲(chóng)）都有表達(dá)，具有重要的調(diào)節(jié)作用。隨著對(duì)FKS06結(jié)合蛋白研究的逐漸深入，其作用機(jī)制越來(lái)越清楚。劉國(guó)通等研究表明，F(xiàn)KS06單獨(dú)并不能發(fā)揮免疫抑制作用，它需要先與FKBP12結(jié)合才能發(fā)揮作用，當(dāng)FKS06與FK-BP12結(jié)合后，F(xiàn)K506特有的立體化學(xué)結(jié)構(gòu)就會(huì)抑制FKBP12的肽基脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶活性，F(xiàn)KBP12在FK506的免疫抑制作用中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本實(shí)驗(yàn)室前期驗(yàn)證了FKBP可抑制鈣調(diào)磷酸酶活性，進(jìn)一步誘導(dǎo)東亞飛蝗滯育。鈣調(diào)磷酸酶可以與Toll途徑下游Dorsal結(jié)合并使其去磷酸化，使轉(zhuǎn)錄因子Dif轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，調(diào)節(jié)抗菌肽、防衛(wèi)素、防御素等基因的表達(dá)。因此，我們推測(cè)FKBP作為鈣調(diào)磷酸酶抑制劑會(huì)影響飛蝗體液免疫Toll途徑級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)金龜子綠僵菌的侵染。

本試驗(yàn)克隆得到了長(zhǎng)度為1242bp，含有完整FKBP_C結(jié)構(gòu)域的一段FKBP序列，經(jīng)過(guò)NCBI檢索，確定克隆出的蛋白是FKBP_C超家族成員之一，與黑腹果蠅Drosophila melanogaster、家蠶中預(yù)測(cè)的結(jié)構(gòu)相同;通過(guò)原核表達(dá)獲得FKBP52蛋白，SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果表明，該蛋白分子量46 kDa，與推測(cè)的分子量大小一致。通過(guò)對(duì)FKBP52基因在飛蝗不同發(fā)育時(shí)期和成蟲(chóng)不同組織中的相對(duì)表達(dá)量分析，發(fā)現(xiàn)FKBP52蛋白在中腸和脂肪體中的表達(dá)量相對(duì)較高。脂肪體是昆蟲(chóng)重要的免疫器官。因此，我們推測(cè)FKBP52蛋白對(duì)飛蝗免疫反應(yīng)有著重要的作用。通過(guò)對(duì)FKBP52基因在蝗蟲(chóng)不同發(fā)育階段中腸內(nèi)的表達(dá)情況分析，發(fā)現(xiàn)其在蝗蟲(chóng)各發(fā)育階段均有表達(dá)，但卵期與成蟲(chóng)期表達(dá)量明顯高于幼蟲(chóng)期，在幼蟲(chóng)階段的表達(dá)量基本相對(duì)穩(wěn)定，這與柞蠶Antheraea pernyi中FKBP基因在不同發(fā)育階段的表達(dá)譜相一致。

氧化還原反應(yīng)是昆蟲(chóng)體內(nèi)重要的化學(xué)反應(yīng)之一，決定著昆蟲(chóng)的衰老與死亡，也會(huì)產(chǎn)生對(duì)蟲(chóng)體有害的活性氧，包括超氧陰離子、過(guò)氧化氫、羥基自由基等?；钚匝醯漠a(chǎn)生會(huì)對(duì)蟲(chóng)體造成傷害，引起體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化，DNA突變和酶失活等。在長(zhǎng)期的發(fā)育進(jìn)化過(guò)程中，昆蟲(chóng)形成了一套完整的保護(hù)系統(tǒng)，來(lái)清除各種活性氧。過(guò)氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）作為昆蟲(chóng)體內(nèi)氧化自由基的清除系統(tǒng)，能夠協(xié)調(diào)體內(nèi)氧自由基處于一種動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，使機(jī)體免受傷害。王龍江等研究表明，紅火蟻Solenopsis invicta被白僵菌Beau-veria bassiana侵染后體內(nèi)CAT、SOD酶活力一直高于對(duì)照組，POD則表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。張彥豐等研究發(fā)現(xiàn)，金龜子綠僵菌侵染能使蝗蟲(chóng)體內(nèi)保護(hù)酶活力發(fā)生變化，呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，蝗蟲(chóng)免疫降低，最終導(dǎo)致蝗蟲(chóng)死亡。本試驗(yàn)通過(guò)FKBP52與金龜子綠僵菌共同處理東亞飛蝗發(fā)現(xiàn)，二者共用可以使蝗蟲(chóng)的死亡率大大提高，且蝗蟲(chóng)體內(nèi)的POD和SOD酶活力都顯著降低，表明FKBP52蛋白能夠有效抑制蝗蟲(chóng)免疫能力，能夠作為正調(diào)控因子加強(qiáng)病菌的侵入，增強(qiáng)對(duì)寄主的致病力，提高死亡率。本研究為金龜子綠僵菌制劑的研制和蝗蟲(chóng)防治提供了新的思路與借鑒。