寧夏馬鈴薯僵頂植原體的分子鑒定

李正男 馬強 張磊 孫平平 趙文軍 周洪友

關鍵詞馬鈴薯僵頂植原體;16S rRNA基因;rp基因

馬鈴薯是我國主要糧食作物之一，是世界上僅次于水稻、玉米、小麥之后的第四大糧食作物，對我國糧食安全具有重要戰略意義。我國馬鈴薯種植區主要劃分為西北、西南、內蒙古和東北四大優勢產區。寧夏屬于西北馬鈴薯優勢產區，2016年，我國馬鈴薯種植面積為554.52萬h㎡，寧夏馬鈴薯種植面積為16.88萬h㎡，馬鈴薯種植業已經發展成為當地農民脫貧致富的主導產業。隨著馬鈴薯種植面積的擴大，病害的發生已經發展成為制約我國馬鈴薯高產、優產的主要因素，除傳統的晚疫病Phytophthora in fstarts、黑脛病Pectobacte-rium spp.、環腐病Clavibacter michiganensis sub-sp.sepedonicus和病毒病外，由植原體引起的馬鈴薯僵頂?。╬otato stolbur）日益發展成為主要病害。

馬鈴薯僵頂病是一種植原體病害，發生普遍、傳播迅速、危害嚴重。其癥狀主要表現為葉片上卷、紅葉或紫葉、節點膨大、節間縮短、芽增殖、氣生薯和早衰，部分發病輕的植株地下薯塊雖然無肉眼可見癥狀，但質地蓬松（海綿薯），在加工過程中品相變差，如制作炸薯片時，會出現薯片褐變，喪失食用和經濟價值。馬鈴薯僵頂病的流行主要有以下兩方面原因，第一，由介體昆蟲甜菜葉蟬Circuli fer tenel-lus傳播，散布迅速;第二，通過薯塊營養繁殖傳播。據報道，該病害在北美、南美、歐洲、新西蘭、俄羅斯和伊朗均有發生，并且引起嚴重的馬鈴薯減產。已經確認馬鈴薯僵頂病可由16SrⅠ、16SrⅡ、16SrⅢ、16SrⅥ、16Sr X、16SrⅫ、16SrXⅢ和16SrXⅧ組植原體引起。在我國云南和內蒙古個別馬鈴薯種植區內，馬鈴薯僵頂病的發生率達80%～100%，由16SrⅠ和16SrⅫ組植原體引起。

寧夏作為我國馬鈴薯的主產區之一，是否有馬鈴薯僵頂病發生，其病原的分類地位等尚不清楚。為此，我們開展了寧夏馬鈴薯僵頂病調查和病原鑒定，以期為馬鈴薯僵頂病的預測及病原菌研究奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

2018年9月10日-17日自寧夏回族自治區固原市彭陽縣紅河鎮采集表現葉片上卷、紅葉、節問縮短、氣生薯、根系壞死等癥狀的馬鈴薯樣品，馬鈴薯品種為‘費烏瑞它。用于分子檢測的樣品采樣方法如下：每株取5～8片新葉，以錫箔紙包裹后迅速液氮冷凍，通過干冰運回實驗室，保存于超低溫冰箱（-86℃）備用，其中有癥狀樣品10個，無癥狀樣品3個。用于透射電鏡觀察的樣品采樣方法如下：取10～15cm有癥狀植株莖尖，用打濕的報紙迅速包起來，保存在泡沫塑料盒中，帶回實驗室。在分類上屬于16SrⅠ-B亞組的苦楝叢枝樣品為本實驗室保存。

Ex Taq DNA Polymerase.dNTPs（2.5 retool/L）、克隆載體PMDl9-T simple vector、DH5a感受態細胞均購自寶生物工程（大連）有限公司。瓊脂糖凝膠回收試劑盒、高純度質粒小量快速提取試劑盒購自艾德萊生物技術有限公司。1 kb DNA Ladder購自北京天根生化科技有限公司。

1.2透射電子顯微鏡觀察

從顯癥馬鈴薯葉脈取2mm×2mm大小的韌皮部組織，將樣品先用3%的戊二醛和4%的多聚甲醛混合物固定4h，然后用1%鋨酸再次固定2h，10%～70%的乙醇和0～100%的丙酮逐級脫水，用812環氧樹脂包埋，在烘箱內烘干72h后取出修塊，修塊完成后切半薄切片，定位到韌皮部組織后進行超薄切片，將超薄切片以醋酸鈾酰及檸檬酸鉛進行雙重染色，用JEM-1200X透射電鏡觀察并拍照。

1.3總DNA提取

采用CTAB法提取凍存的13個馬鈴薯葉片樣品總DNA，溶解于50μL滅菌雙蒸水中，采用Eppendorf BioPhotometer D30核酸蛋白測定儀測定DNA濃度，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性后將總DNA保存于超低溫冰箱（-86℃）中備用。苦楝叢枝樣品DNA提取方法同上。

1.4馬鈴薯僵頂病的PCR檢測

16S rRNA基因的PCR擴增：以提取的總DNA為模板，用植原體16S rRNA基因通用引物P1（5，-AAGAGTTATCCTGGCTCAGGATT-3）和P7進行擴增。擴增程序為：98℃預變性3min;98℃ 1 min，50℃2min，72℃ 3min，35個循環;72℃10min。將第一輪PCR產物稀釋30倍作為模板，用引物R16F2n進行第二輪PCR，擴增程序為：98℃預變性3min;98℃1min，52℃1 min，72℃1min，先進行5個循環，然后以94℃30 s，50℃1min，72℃2min，進行25個循環;72℃延伸10min。

rp基因的PCR擴增：使用植原體rp基因通用引物rpF1C（5，-ATGGTDGGDCAYAARTTAGG-3）和rp（I）RIA（5-GTTCTTTTTGGCATTAA-CAT-3）進行擴增。擴增程序為：98℃預變性11min;98℃ 1min，50℃2min，72℃3min，38個循環;72℃延伸7 min。

取5μL PCR產物，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，EB染色后在凝膠成像系統下成像。PCR反應以健康馬鈴薯總DNA為陰性對照，采集自陜西省楊凌區西北農林科技大學校園的苦楝叢枝樣品DNA為陽性對照。

1.5PCR產物的純化、克隆及序列測定

采用快捷型瓊脂糖DNA回收試劑盒純化PCR產物，純化產物與PMDl9-T simple vector 16℃連接1h，將連接產物轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞，經過藍白斑篩選后，挑取篩選平板上的白色菌落，在3 mL Amp抗性的LB液體培養基中培養過夜，經過PCR鑒定為陽性的菌液提取質粒，重組質粒送上海生工生物技術有限公司進行測序。

1.6序列一致性比較分析

采用Vector NTI Advancell（Invitrogen Corp.）軟件對測序結果進行校正和拼接;將獲得的16S rRNA和rp基因序列進行BLASTn比對檢索同源序列并提交GenBank;通過DNAMAN軟件將測定的16SrRNA基因和rp基因序列與同組植原體代表株系進行核酸一致性比較;通過MEGA 6.0軟件分別構建16S rRNA基因和rp基因系統發育進化樹。

2結果與分析

2.1馬鈴薯僵頂病癥狀

2018年9月10日-17日，對寧夏回族自治區固原市彭陽縣紅河鎮馬鈴薯僵頂病進行了調查，調查標準主要是看馬鈴薯田里是否存在葉片上卷、紅葉、節問縮短、氣生薯和根系壞死癥狀的植株。結果發現，表現上述癥狀的馬鈴薯植株在薯田內零星發生，共采集了10株有癥狀的馬鈴薯葉片樣品，3株無癥狀馬鈴薯葉片樣品（圖1）。

2.2電鏡結果

通過透射電子顯微鏡在感病馬鈴薯韌皮部篩管細胞內觀察到大量球形的植原體粒子，大小在500～700nm（圖2）。

2.3 PCR鑒定結果

利用植原體16S rRNA基因和rp基因通用引物從有癥狀的10個馬鈴薯樣品和陽性對照中均擴增出長度約1.2 kb的16S rRNA基因和rp基因，而3個無癥狀馬鈴薯樣品中未擴增出特異性條帶。證明了表現葉片內卷、紅葉、節問短縮、氣生薯和根系壞死癥狀的馬鈴薯中有植原體存在。

2.4一致性分析和系統發育分析

從10個PCR鑒定為植原體陽性的馬鈴薯樣品中隨機選擇2、4、7、9號樣品進行16S rRNA基因和rp基因克隆，16S rRNA基因和rp基因均選擇3個陽性克隆進行測序，4個樣品彼此問16S rRNA基因和rp基因的一致性為100.0 %，我們將該植原體命名為馬鈴薯僵頂植原體寧夏株系（potato stolburphytoplasma strain Ningxia，PSp-Nx），16S rRNA片段長度為1246 bp，G+C含量為46.79%，登錄號為MK696087;rp基因長度為1182 bp，登錄號為MK695939。通過BLASTn程序，將獲得的馬鈴薯僵頂植原體寧夏株系16S rRNA基因序列和rp基因序列在GenBank中進行同源序列搜索，分別搜索到99條同源序列，99條序列均屬于僵頂組（16SrⅫ組）成員，其16Sr RNA基因與‘Ca.P.ffagariae槭樹株系（MK501642）16S rRNA基因一致性最高，為99.70%，rp基因與‘P.fragariae云南馬鈴薯YN-2G株系（KJl44889）rp基因一致性最高，達到100.0%。

利用MEGA 6.0軟件將馬鈴薯僵頂植原體寧夏株系16S rRNA基因序列與僵頂組植原體11個亞組（A-K）代表及其他各植原體組代表的16SrRNA基因序列進行比較，構建系統發育進化樹（圖3）。從圖中可以看出馬鈴薯僵頂植原體寧夏株系與僵頂組植原體11個亞組代表株系聚集在一起形成一個大的分支，其中又與16SrⅫ-E亞組的代表株系‘ca.P.fragariae草莓株系（DQ086423）聚集在一起形成獨立分支。馬鈴薯僵頂植原體寧夏株系rp基因序列與僵頂組植原體5個代表及其他各植原體組代表的rp基因序列進行比較，構建系統發育進化樹（圖4）。從圖中可以看出馬鈴薯僵頂植原體寧夏株系與僵頂組植原體5個代表株系聚集在一起形成一個大的分支，其中又與分類屬于16SrⅫ-E亞組的‘ca.P.fragariae云南馬鈴薯YN-2G株系（KJl44889）聚集在一起。

基于對16S rRNA基因和rp基因的核酸一致性分析和系統發育分析，均證明馬鈴薯僵頂植原體寧夏株系屬于16SrⅫ組，并且該分離物與16SrⅫ-E亞組親緣關系最近。

3討論

在本研究中透射電鏡和分子檢測結果均證明在寧夏發生的馬鈴薯僵頂病與植原體有關;其16SrRNA基因和rp基因的一致性分析和系統發育分析證明該植原體屬于16SrⅫ組，并且與16SrⅫ-E亞組親緣關系最近。

之前的研究表明在我國北方地區16SrⅠ組和16SrV組植原體發生最為普遍，南方地區16SrⅠ組和16SrⅡ組植原體發生最為普遍_2，但近年來越來越多的研究報道僵頂組（16SrⅫ組）植原體在我國的發生，其中Gao等報道了16SrⅫ組一個新的亞組在山東牡丹上的發生，Yang等報道了16SrⅫ-A亞組在陜西丹參上的發生，Wu等報道了16SrⅫ-c亞組在云南黃槐樹上的發生，Cheng等報道了16SrⅫ-E、16SrⅫ-I亞組在我國云南和內蒙古馬鈴薯上的發生，由此，我們可以看到16Sr組植原體在我國不同地區正在廣泛發生。由16Sr組植原體引起的病害已經發展成為北歐最嚴重的植原體病害，因此16Sr組植原體在我國的發生值得引起重視。

在我國西北馬鈴薯產區的陜西、西南馬鈴薯產區的云南、內蒙古馬鈴薯產區分別有16SrⅠ-B、16SrⅥ-A、16SrⅫ-E、16SrⅫ-I亞組植原體侵染馬鈴薯引起僵頂病的報道，但在寧夏和黑龍江等馬鈴薯產區還沒有馬鈴薯僵頂病發生的報道，本研究對寧夏馬鈴薯產區進行了調查，并證明在寧夏有16SrⅫ-E亞組植原體引起的馬鈴薯僵頂病。結合上面研究結果證明與植原體相關的馬鈴薯僵頂病在我國馬鈴薯產區普遍發生。雖然在本研究中鑒定到的馬鈴薯僵頂植原體寧夏株系與在云南和內蒙古鑒定到的馬鈴薯僵頂植原體均屬于16SrⅫ-E亞組，但馬鈴薯僵頂植原體寧夏株系16S rRNA基因卻與在比利時發生的‘ca.P.fragariae槭樹株系（MK501642）一致性最高，為99.70%，說明馬鈴薯僵頂植原體寧夏株系與云南和內蒙古株系存在一定變異。在世界范圍內已經有16SrI、16SrII、16SrIII、16SrVI、16SrX、16SrⅫ、16SrⅫ在馬鈴薯上引起僵頂病的報道，結合我國的研究結果可以看出引起馬鈴薯僵頂病的植原體病原多樣，植原體由刺吸式口器昆蟲傳播，這類昆蟲食性廣泛，它們可能會在感染了不同組植原體或者同組不同亞組植原體的植株上取食，這可能是導致馬鈴薯僵頂病植原體病原多樣性的原因，在油菜、葡萄、長春花等植物上也存在分類上屬于不同組的多個植原體組植原體侵染的報道。我國不同馬鈴薯產區僵頂病的發生情況、病原多樣性和效應因子鑒定將是我們后續工作的重點。