可可毛色二孢效應子LT_397基因的克隆及轉錄分析

曹陽 邢啟凱 李鈴仙 徐品三

關鍵詞可可毛色二孢;LT-397基因;生物信息學;逆境脅迫;過敏反應

葡萄屬于葡萄科葡萄屬木質藤本植物。葡萄因具有營養價值高、易加工等特點，深受人們的喜愛。2018年，我國葡萄的種植面積約87萬hme（國家葡萄產業技術體系）。但葡萄病害長期制約葡萄產業的健康發展，其中由葡萄座腔菌科Botryosphaeriaceae真菌引起的葡萄潰瘍?。˙ot-ryosphaeria dieback）是一種重要的葡萄枝干病害。該病害引起枝干潰瘍、果梗干枯、掉粒等病征，嚴重時會造成整株植株枯死。在我國葡萄產區共發現6種葡萄座腔菌科真菌可引起葡萄潰瘍病，分別是Botryosphaeria dothidea、Diplodia seriata、Lasiodiplodia theobromae、Neofusicoccum par-rum、L.pseudotheobromae和Neofusicoccumman-gi ferae，優勢病原菌為葡萄座腔菌B.dothidea和可可毛色二孢L.theobromae，致病性最強的是可可毛色二孢。目前對葡萄潰瘍病的研究主要集中在病原真菌的分離鑒定、種群結構和化學防治等方面，對主要致病菌可可毛色二孢L.theobromae的致病機制尚不明晰。

在植物與病原物的長期協同互作過程中，植物形成了多種免疫機制來阻止病原物的侵染;同時病原物也進化出多種致病機制來克服宿主的防衛反應，最終使宿主發病。效應子是一類由病原菌產生，通常富含半胱氨酸的蛋白分子，可分泌到寄主植物細胞問或細胞內，抑制寄主的防御反應，從而促使病原菌在寄主植物上定殖、侵入和擴展。已發現真菌效應子主要通過靶標蛋白來影響植物的PTI（PAMP triggered immunity）防御反應，如小麥條銹菌Puccinia striifrmis f.sp.tritici效應基因PEC6可以與擬南芥和小麥中的腺苷激酶互作，從而抑制寄主PTI，促進小麥條銹菌在寄主中的侵染。稻瘟菌Magnaporthe oryzae效應基因SLP1與番茄葉霉病菌Cladosporiumfulvum效應基因ECP6含有保守的LysM結構域，能與植物幾丁質結合受體競爭結合幾丁質，從而逃避PTI防御反應。植物激素對調控植物的防御機制起著重要的作用，真菌效應基因也通過影響植物激素的合成來調控植物的防御反應。例如玉米黑粉菌Usti-lago maydis分泌的效應子Cmul能夠催化水楊酸的前體物質分支酸轉為預苯酸（prephenic acid），抑制水楊酸的生物合成，影響水楊酸信號傳導途徑。某些真菌效應子通過干擾宿主植物的活性氧生成來抑制植物的防御反應，玉米黑粉菌的效應子Pepl直接與玉米的過氧化物酶POX12互作抑制活性氧介導的免疫反應。病原真菌效應蛋白也可以通過抑制RNA沉默來抑制植物的防御反應，小麥稈銹菌P.graminis f.sp.tritici效應子PgtSRl通過改變防御調節因子小RNA的豐富度來抑制植物RNA沉默誘導的防御機制。總之效應子可以通過不同的信號途徑來抑制寄主的免疫反應，從而使病原物能夠完成侵染、定殖寄主植物的過程。Yan等對L.theobromae進行全基因測序組裝分析，并結合生物信息學方法預測發現：共359個具有效應子特征的基因。但目前對可可毛色二孢效應子的功能研究還未見報道，效應子與寄主葡萄之問的互作機制并不明晰。

探究效應子基因的轉錄模式及致病性對研究病原菌效應子與寄主植物的作用機制有重要意義。本試驗對可可毛色二孢特有的效應子基因LT_397進行克隆，得到目的基因ORF全長并進行生物信息學分析，對LT_397基因受可可毛色二孢誘導轉錄分析和逆境脅迫轉錄分析，利用煙草毒力測定體系對效應子LT_397進行毒力測定。研究結果為進一步分析病原菌對寄主的作用機制提供了理論基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

可可毛色二孢菌株CSS-O1s由本實驗室分離并保存。水稻谷枯病菌（穎殼伯克氏菌）Burkholderiaglumae菌株106619和pEDV5載體由中國農業大學孫文獻課題組饋贈。本氏煙Nicotianabenthamiana培養條件為26℃，L//D=14 h//10h，取生長4周煙草進行接種試驗。

完全培養基（cM）：6g/L酵母提取物、3g/L酪蛋白、10g/L葡萄糖和0.1%（V/V）微量元素混合液;基礎培養基（MM）：6g/L NaN03、0.5g/LKC1、1.5g/L KH2P04、0.5g/L MgS04、10g/L葡萄糖;缺碳源基礎培養基（MM-C）：6 g/L NaNO3、0.5g/L KCl、1.5g/L KH2P04、0.5g/L MgS04;缺氮源基礎培養基（MM-N）：0.5g/L KC1、1.5g/LKH2P04、0.5g/L MgS04、10g/L葡萄糖;培養基pH均調至6.5。

LA Taq DNA聚合酶、pMDl8-T載體、SYBRPremix Ex TaqTM購自寶生物工程有限公司。Trizol和反轉錄酶SuperScript*Ⅲ購自Invitrogen公司。大腸桿菌Escherichia coli Trans5a感受態購自全式金生物技術有限公司。其他常規化學藥品均為分析純。

1.2試驗方法

1.2.1 LT 397基因的克隆

采用TRIzol法（Invitrogen）提取可可毛色二孢用DNA凝膠回收試劑盒對目的基因進行純化回收，并與pMDl8-T載體連接，轉化大腸桿菌Trans5a，挑取單克隆進行菌液PCR驗證，陽性克隆送至北京擎科新業生物技術有限公司進行測序。

1.2.2效應子LT397的生物信息學分析

利用Edit Seq和ExPAsy軟件對LT_397進行氨基酸序列分析;Signal P 4.1 Server預測LT_397氨基酸序列信號肽;使用Protscale和SOPMA軟件測定LT_397跨膜螺旋等二級結構和蛋白質表面氨基酸分布;Swiss-Model預測LT_397蛋白的結構模型。

1.2.3逆境脅迫處理對LT_397基因轉錄水平的影響

檢測不同脅迫處理條件下可可毛色二孢CSS-01s效應子LT_397基因的轉錄情況。營養脅迫處理：將CSS-01s菌株于CM液體培養基上26℃160 r/min搖培24h，離心收集菌絲，隨后將菌絲分別置于缺碳源MM-C和缺氮源MM-N培養基上生長4h。氧化脅迫處理：將CSS-01s在CM液體培養基上培養24h后，向培養基里分別加入HzOz至終濃度為5mmol/L和10mmol/L處理4h。高溫脅迫處理：CSS-01s在CM液體培養基上培養24h，轉移到42℃培養箱靜止45min。離子脅迫處理：CSS-01s在CM液體培養基上培養24h，離心收集菌絲，分別轉移到濃度為1mol/L NaCl和濃度為0.1mol/L LiCl的MM培養基中處理4h。酸堿脅迫處理：CSS-01s在CM液體培養基上培養24h，離心收集菌絲，轉移到pH分別為4和8的MM培養基中處理4h。紫外線UV脅迫處理：將CSS-01s在CM液體培養基上培養24h后，用UV-B輻射測定儀（北京師范大學光電儀器廠）進行測定，輻射強度為5kJ/m2，分別設處理時問為5min和10min。處理完畢后，將離心收集的菌絲置于液氮中速凍，-80℃保存。

1.2.4qRT-PCR檢測LT_397基因的轉錄水平

液氮研磨菌絲后，采用TRIzol（Invitrogen）法對處理樣本RNA進行提取。RNA經DNase I（TaKaRa）消化處理后，運用SuperScriptⅢ（Invitrogen）反轉錄合成第一鏈cDNA為模板進行實時定量PCR擴增（qRT-PCR）。設計qRT-PCR特異性引物，LT_397基因（登錄號GenBank：KAB2577062.1）（F：5-CAT-CACCTACACCACAC-3;R：5'-CTCCTTGTCG-TATTCAGTCT-3）;LtActin基因（登錄號GenBank：AY846879.1），（F：5'-TCTTCGCFCGAGAAGTCC-TA-3;R：5-ACAATCG-AACGTCCTC-3）。參照TaKaRa說明書，采用SYBR Green I染料法進行熒光定量PCR，反應在ABl7500 Reabtime PCR檢測系統上進行。PCR反應體系：10μL SYBRPremix Ex TaqTM、0.5μL上游引物（10μmol/L）、0.5μL下游引物（10μtnol/L）、0.4μL ROX Refer-enceDye II，0.5μL cDNA模板、補水至20μL。反應程序為：95℃預變性3 min;95℃30 s，60℃30 s，72℃30 s共40個循環。每批檢測3次，設3個生物學重復。根據實時熒光定量PCR得到的ct值以及標準曲線，采用2法分析試驗數據。以接種可可毛色二孢時問0h作為參照（轉錄水平為1），計算LT_397基因受可可毛色二孢不同侵染時間的相對轉錄水平。以未做脅迫處理的樣本CK作為參照（轉錄水平為1），計算LT_397基因逆境脅迫處理時的相對轉錄水平。

1.2.5效應蛋白LT_397毒力測定

以397-T為模板，用引物397F（5-ACTC-GAGGGCCCTGTGGAAAAGCGTC-3）和397R（5'-AGGATCCGTTGGCGTCTTCGTAAACG-3）進行PCR擴增（擴增反應1.2.1），擴增得到的片段連接到T載體上，得到的重組載體命名為397XB-T。由北京擎科新業生物技術有限公司進行測序驗證。用Xho I和BamHI雙酶切397XB-T載體，回收小片段插入到pEDV5載體的Xho I和BamHI酶切位點間，得到的重組載體命名為pEDV-397。

參照Sharma等和Zhang等的方案，挑取穎殼伯克氏菌單菌落接種于LB液體培養基，28℃振蕩培養至0D=0.8。4℃下800g離心10min，棄去上清。用25mL預冷的10%甘油溶液輕輕懸浮細胞，4℃下800g離心10min，棄上清，重復上述步驟一次。最后加入700μL預冷的10%甘油溶液懸浮細胞，即為穎殼伯克氏菌感受態細胞。采用電激轉化方法，將pEDV-397載體轉入穎殼伯克氏菌感受態細胞。取200μL培養液，涂布于含25mg/L慶大霉素（gentamicin）的LB固體平板上，28℃倒置培養篩選獲得轉化子，并利用PCR驗證轉化子是否構建成功。

將轉化子和空載菌株接種于10mL含有25mgLGM的LB液體培養基中，28℃，180r/min振蕩培養過夜。用0.9%NaCl調整OD=0.1。用1mL注射器將菌液注射人煙草葉片下表皮。2～3d后觀察細胞壞死情況。

2結果與分析

2.1 LT_397基因PCR結果分析

設計特異性引物，以可可毛色二孢的cDNA為模板，克隆LT_397基因，測序分析結果表明，LT_397開放閱讀框（ORF）全長1140 bp（圖1）。

2.2 LT_397蛋白的基本性質與功能分析

2.2.1 LT_397蛋白的氨基酸序列分析

以NCBI中基因登錄號KAB2577062.1序列為參照序列，利用ExPAsy在線軟件分析LT_397的開放閱讀框。如圖2所示：LT_397基因是編碼379個氨基酸的多肽。Edit Seq軟件分析該多肽相對分子質量約為40.8 kD，有17個堿性氨基酸、51個酸性氨基酸、131個疏水性氨基酸和137個極性氨基酸，含有11個Cys。等電點為3.79，在pH為7時，電荷為-34.06。

2.2.2 LT_397信號肽分析

信號肽指的是一段通常位于蛋白質N端，在新合成的多肽鏈中指導蛋白質合成及跨膜轉移，大小為15～30個的氨基酸多肽。它一般由3部分組成，即疏水核心區、信號肽的c端和N端。使用Sig-nal P 4.1 Server在線軟件對可可毛色二孢效應子LT_397蛋白序列進行分析，預測其信號肽由16個氨基酸組成（圖3）。

2.2.3 LT_397蛋白的親水性和疏水性分析

維持蛋白質結構特征的主要因素是疏水和親水問的平衡。疏水作用有利于與氨基酸的基團形成氫鍵等作用力使蛋白質結構穩定，因而蛋白質的穩定性很大程度上依賴于分子內的疏水相互作用。使用在線軟件Protscale分析LT_397蛋白分子的親水性和疏水性，并根據蛋白的得分數（Score）來計算蛋白的親、疏水性。結果表明，該蛋白的氨基酸Score值在3～-3.5（圖4）。疏水性質用正值來表示，親水性質用負值表示，且絕對值越大，親、疏水的性質則越明顯。用Protscale工具統計分析顯示GRAVY值為-0.244（最小值：-3.300，最大值：2.711），表明LT_397為具有較強親水性的蛋白質。LT_397蛋白前15～20個氨基酸均為疏水性氨基酸，表明在N端有一典型的疏水區域，可能與信號肽的組成相關。

2.2.4 LT_397蛋白二級結構分析

使用在線軟件SOPMA對LT_397蛋白的二級結構進行分析，結果顯示LT_397氨基酸序列的二級結構是由31.13%的a螺旋、15.83%的延伸鏈區和49.39%的無規則卷曲并通過3.43%的β轉角進行連接構成。

2.2.5 LT_397蛋白三級結構分析

使用Blast P對LT_397蛋白進行同源序列比對，選擇同源序列E值低的氨基酸序列OMP81863.1作為預測模板，并使用Swiss-Model查詢同源序列的蛋白質三級結構，從而預測得到LT_397蛋白三級結構。結果如圖5所示：LT_397是單體，沒有與其結合的配體;該蛋白質三級結構主要由2個螺旋結構并通過a螺旋和無規則的殘基片段構成，并且通過β轉角連接、折疊形成這種“背包形”的蛋白結構。

2.3 LT_397受逆境脅迫誘導轉錄分析

以LtActin基因作為內參基因，利用qRT-PCR分析不同侵染時問下可可毛色二孢對LT_397基因轉錄水平的影響。LT_397受到可可毛色二孢誘導上調表達，相對轉錄水平在24 h達到最高，是對照的2.85倍，之后轉錄水平逐漸下降（圖6）?？煽擅呙{迫處理后效應子LT_397基因的相對轉錄水平均高于未脅迫處理樣本（圖7）。在營養吸收方面，氮元素的缺少誘導LT_397基因的相對轉錄水平上升明顯，相對轉錄水平為18.86;氧化脅迫處理中，基因的相對轉錄水平隨Hz 02濃度的增加呈上升趨勢，10mmol/L Hz 02處理下基因的相對轉錄水平為15.20;熱脅迫處理中，45℃高溫處理的樣本相對轉錄水平為3.98;在離子脅迫下，NaCl處理的樣本中LT_397基因的相對轉錄水平是4.75，而LiCl處理下相對轉錄水平與對照水平相比，轉錄水平微上調，相對轉錄水平為2.30;酸堿脅迫處理發現：與適宜的pH值5～7相比，弱酸弱堿都會造成LT_397基因轉錄水平的上升，但堿性條件下基因的轉錄水平更高，相對轉錄水平為8.66;UV脅迫發現：紫外線照射時問越長，LT_397基因相對轉錄水平越高，UV照射10 min的LT_397基因相對轉錄水平為18.78。

2.4效應子LT_397可抑制穎殼伯克氏菌誘導的HR反應

效應子LT_397轉入穎殼伯克氏菌感受態細胞后，在含有25mg/L慶大霉素的LB固體平板上挑取生長的單克隆轉化子，進行菌液PCR驗證。如圖8所示：陽性轉化子PCR擴增得到約1000bp大小片段，陰性對照pEDV空載體無假陽性的條帶出現。將驗證成功的轉化子進行測序驗證，也證明重組質粒pEDV-397構建成功。

植物病原真菌通常通過效應因子克服宿主免疫。穎殼伯克氏菌自身能夠在本生煙上誘導很強的過敏性壞死反應。因此我們構建了pEDV-397載體，利用穎殼伯克氏菌三型分泌系統將效應子LT_397分泌到植物細胞內。結果如圖9a所示，在本生煙上瞬時表達效應子LT_397，正常條件下生長3d后觀察發現：瞬時表達效應子LT_397的葉片HR面積小于對照。選取10組處理樣品測量HR反應直徑，統計結果如圖9b所示，在煙草葉片中，表達效應子LT_397的HR反應平均長度為0.55cm，而對照組平均長度為1.74cm，說明該效應子可抑制穎殼伯克氏菌誘導的HR反應。

3討論

大量研究報道發現，植物病原真菌效應子通過多種途徑抑制寄主植物的防衛反應，使病原真菌成功在寄主體內定殖、侵入和擴展。然而關于葡萄枝干病害的病原效應子功能的研究還未見報道。本試驗克隆了可可毛色二孢特有的效應子LT_397基因，并利用生物信息學手段對該蛋白進行理化性質、二級結構和功能結構域預測分析，其編碼的氨基酸N端具有一個典型的信號肽區段，含有11個Cys屬于分泌蛋白。利用實時定量PCR技術分析LT_397基因在不同脅迫處理的轉錄模式發現：高溫、H2Q2、UV處理均可誘導該基因轉錄水平的提高。

病原真菌效應子對植物免疫系統的調控作用，可通過煙草的細胞壞死反應進行快速檢測。部分效應子在煙草的超表達可以引起煙草細胞壞死，另外的效應子可抑制不同激發子誘導的細胞壞死。本研究通過煙草毒力試驗證實：效應子LT_397可抑制穎殼伯克氏菌誘導的HR反應，可能對可可毛色二孢的毒性有一定的促進作用。

可可毛色二孢是一種半活體營養型真菌，在侵染植物的早期需要從活體中吸取營養物質，而在侵染后期，則要殺死寄主植物，轉換到死體營養，從死體植物組織中吸收營養物質。在可可毛色二孢中可能存在大量功能特異的效應子，它們可能在該病原侵染寄主過程中發揮重要作用。有關可可毛色二孢效應子的作用機制研究有待進一步通過基因編輯、蛋白互作等進行深入分析。通過探索LT_397等效應子的生物學功能以及作用機制研究，將有利于揭示可可毛色二孢的致病機制，進一步尋找和設計藥物新靶點，為創建持久、高效的綠色防治技術提供理論基礎。