枸杞褐斑病菌stigmella lycii生物學特性研究

王艷 晉玲 申培增 呂嬌嬌

關鍵詞枸杞褐斑病;枸杞小黑梨孢;生物學特性

枸杞屬茄科Solanaceae落葉灌木，主要以果實人藥，具滋肝補腎、益精明日之功效;根皮亦可入藥，俗稱地骨皮，具涼血除蒸、清肺降火之功效。枸杞主要分布于我國寧夏、甘肅、內蒙古、新疆等省區。甘肅省白銀、酒泉、武威、金昌和張掖5市發展為枸杞主產區，年種植面積在3萬～4萬hm。但是隨著栽培面積的不斷擴大，枸杞病害發生日益嚴重，成為制約其產量和品質的一大因素。

枸杞褐斑病（病原為Stigmella lycii X.R.Chen&Yan Wang）是2010年課題組在甘肅省景泰縣進行枸杞病害調查時發現的一種新病害，癥狀主要表現為在葉片、葉柄及花蕾上產生圓形、近圓形褐色至灰褐色病斑，嚴重時，病斑相互連接，引起大量落葉和落果。據調查，2010年該病害在白銀市的景泰草窩、靖遠五合、靖安等鄉鎮，發病率95%～98%，嚴重度2～4級，減產22%～25%，損失嚴重。該病最早于5月下旬開始發病，發病初期主要從葉緣開始形成褐色凹陷斑塊，7月-9月降雨多，田間濕度大，病原菌再侵染頻繁，病害蔓延迅速。病害持續時間長，可一直持續至枸杞果實采收期。其病原枸杞小黑梨孢S.lycii為目前小黑梨孢屬Stigmella全世界報道的第3個種，在調查中發現，該菌在越冬前的落葉中和離體培養條件下均可形成子囊殼和子囊孢子，即該菌的有性態，課題組通過對該菌的系統發育地位分析表明，該菌為子囊菌門格孢腔菌目格孢腔菌科真菌。

目前國內外對于枸杞小黑梨孢的生物學特性、寄主范圍以及引起的病害情況等均無相關研究報道。因此，本研究通過離體培養的方法測定了枸杞小黑梨孢在不同培養基、溫度、pH、光照條件、相對濕度及不同營養條件下的生物學特性，為確定枸杞褐斑病在田間侵染和擴散的氣象條件、病害的發生發展規律及制定綜合防治措施提供一定的理論依據。

1材料與方法

1.1供試菌種

2016年自甘肅省景泰縣草窩鄉大田采集具有典型癥狀的枸杞褐斑病葉，經PDA分離培養，鏡檢確定為Stigmella lycii，純化后接種使健康枸杞葉片發病的病菌，于4℃保存備用。

1.2生物學特性測定

1.2.1不同培養基對菌絲生長和產孢的影響

在生長20 d的菌落邊緣打取菌餅（d=7mm）接種于以下11種供試培養基：1%枸杞葉（果）煎汁（取100g‘寧杞1號枸杞葉或果于1000mL水中煮沸10min，過濾，濾液加水補足1000mL，加入14g瓊脂）、1%枸杞葉煎汁+PDA（馬鈴薯200g，葡萄糖10g，1%枸杞葉煎汁1000mL，瓊脂14g）、1%枸杞果煎汁+PDA（馬鈴薯200g，葡萄糖10g，1%枸杞果煎汁1000mL，瓊脂14g）、淀粉培養基（可溶性淀粉10g，水1000mL）、燕麥培養基（OA）、PDA、PSA、WA、Richard、Czapek培養基和玉米粉蔗糖培養基，每處理3皿，置于25℃±1℃光暗各12h交替條件下培養。菌絲生長量測定采用十字交叉法，每隔2d測定一次菌落直徑（菌落直徑=兩次直徑平均值一接種菌餅直徑）。14d后計測產孢量，在菌落半徑一半處打取菌餅（d=7mm）5塊，置于盛有5mL蒸餾水的試管中，用玻棒搗碎，用血球計數板計測單位面積子囊孢子產孢量，重復5次，求平均值。

1.2.2溫度對菌絲生長、產孢量和孢子萌發的影響

將菌餅接種于PDA平板上，分別置于5、10、15、20、25、30、35℃下培養，菌絲生長量及產孢量的測定方法同1.2.1。選用凹玻片懸滴法測定孢子萌發率，配制子囊孢子（培養菌菌齡30d）懸浮液和分生孢子（自然菌）懸浮液，將孢子懸浮液滴加在潔凈的蓋玻片中央，在其四周涂上少量凡士林，然后將其覆蓋在凹玻片上，每隔1.5h測定一次孢子萌發率，直至10.5h孢子萌發率不再增長時，共測定6次。

1.2.3光照對菌絲生長、產孢量和孢子萌發的影響

將菌餅接種于PDA平板上，分別置于25℃連續光照、光暗12h交替及連續黑暗條件下培養，菌絲生長量及產孢量測定方法同1.2.1。采用凹玻片懸滴法測定孢子萌發率，分別置于20℃連續光照、光暗1.5h交替及連續黑暗條件下培養，每隔1.5h測定一次孢子萌發率。

1.2.4 pH對菌絲生長、產孢量和孢子萌發的影響

采用NaOH和HCl將PDA培養基的pH調整為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0，將菌餅分別接種于上述PDA平板上，25℃下培養。用檸檬酸一磷酸二氫鉀緩沖液配制pH為4.51、5.58、6.49、7.00、7.41、8.39、9.19的孢子懸浮液，20℃下凹玻片懸滴法培養。菌絲生長量及產孢量的測定方法同1.2.1。

1.2.5濕度對孢子萌發的影響

將孢子懸浮液均勻涂抹于載玻片上，在室溫下自然干燥，用小容器調節法，以硫酸控制相對濕度，濕度設置為70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99.5%，以100%飽和濕度為對照，共9個處理，20℃下培養。菌絲生長量及產孢量的測定方法同1.2.1。

1.2.6營養對孢子萌發的影響

測定的營養物共計有6種：葡萄糖、枸杞葉片、枸杞果實、馬糞、土壤（馬糞和田問土壤收集于枸杞褐斑病菌標樣采集地）和尿素。按照1g營養物加入5、10mL和20mL蒸餾水的比例依次配制1：5、1：10、1：20濃度的營養液。枸杞葉片（果實）榨出液：取1g葉片（果實）加入不同體積的蒸餾水，在預冷的研缽中研磨成不同濃度的枸杞葉片（果實）榨出液。馬糞浸漬液和土壤浸漬液：將1g馬糞（土壤）與不同體積的蒸餾水混合，300r/min充分振蕩10min，后靜置30min。取上清液配制孢子懸浮液，20℃下凹玻片懸滴法培養，其他同1.2.1。

2結果與分析

2.1病原菌的培養特性

表1結果表明：病菌在各種培養基上生長緩慢，適溫下于最適培養基（1%枸杞葉煎汁+PDA）上，8d后菌落直徑2.8cm;菌落生長以1%枸杞葉煎汁+PDA.玉米粉蔗糖培養基、1%枸杞果煎汁+PDA最好，14d菌落直徑分別可達4.5、4.4、4.2cm，PDA、1%枸杞葉煎汁、OA、PSA次之，在Richard和WA上病菌不生長。病菌除在1%枸杞葉煎汁、1%枸杞葉煎汁+PDA、1%枸杞果煎汁+PDA.PDA和OA培養基上產生孢子外，在其他培養基上均未產孢，在1%枸杞葉煎汁上產孢量最大，為8.9×10個/cm。

在PDA培養基上，菌落生長速度為0.28 cm/d，菌落微隆起，淡黃褐色，邊緣不整齊，氣生菌絲白色，稀疏，后期密生大量黑色小顆粒，即病菌的子囊殼（圖la）;在OA培養基上，生長速度為0.21 cm/d，菌落平鋪，氣生菌絲非常稀疏，后期產生大量子囊殼，埋生或半埋生于培養基中（圖1b），PSA、1%枸杞果煎汁+PDA和1%枸杞葉煎汁+PDA培養性狀同PDA;在1%枸杞葉煎汁培養基上，生長速度為0.20cm/d，氣生菌絲稀疏，灰白色，絨狀，層層疊起，子囊殼埋生或半埋生于培養基中（圖1c）;在玉米粉蔗糖培養基上菌落生長速度為0.31cm/d，但是菌絲非常稀疏，僅在培養基表面擴展，在其余培養基上病菌僅在原菌餅上產生白色絮狀菌絲。子囊孢子萌發時每個小細胞都能長出芽管（圖1f）。

2.2病原菌的生物學特性

2.2.1溫度對菌絲生長、產孢及孢子萌發的影響

該菌在10～30℃范圍內均能生長，最適溫度為25℃（表2）。病菌生長較緩慢，在25℃下，14d菌落直徑4.5cm，而30℃時僅為0.13cm，表明高溫能抑制該菌正常生長發育。在20～25℃下病菌可以產孢，適宜產孢溫度為25℃，在此溫度下產孢量高達0.9×10個/cm，與其他溫度下的產孢量存在顯著差異。子囊孢子和分生孢子分別在5～30℃和0～35℃可以萌發，20℃和25℃分別為其適宜萌發溫度，萌發最高溫度為30℃和35℃。該菌孢子萌發速度較快，最適溫度下10h萌發率達90%以上。由此可見，該菌菌絲生長較緩慢，即病菌在葉片上擴展速度較慢，而孢子萌發速度較快，有利于初侵染和再侵染，且子囊孢子萌發適溫較分生孢子的低5℃，適宜于越冬后初春引起初侵染。

2.2.2光照對菌落生長、產孢和孢子萌發的影響

表4結果表明，連續光照條件有利于菌絲生長和產孢，培養14d后，產孢量達5.7×10個/cm，與其他處理具有顯著差異;表5結果表明，在光暗交替條件下，子囊孢子萌發率最高，連續光照條件下，分生孢子萌發率量高，10.5 h萌發率分別為93.5%和91.0%。連續光照有利于菌落生長、產孢和分生孢子萌發，但光暗交替有利于子囊孢子萌發。

2.2.3 pH對菌絲生長、產孢和孢子萌發的影響

表6結果表明：病菌生長適宜的pH范圍較寬，在pH 4.0～10.0范圍內均能生長，pH6.5時生長最快，14 d菌落直徑達4.8cm，菌落在堿性條件下生長較好，pH為9.0時菌落直徑4.1cm，顯著大于pH 5.0的3.5 cm;在pH為6.0～7.0時可以產孢，其余pH條件下均不產孢。

表7結果表明：子囊孢子在pH 4.5～9.2范圍內均可萌發，pH7.0時萌發率最高，達93%，堿性條件下萌發率均達83%以上，酸性條件下萌發率除6.5以外均在80%以下。分生孢子在中性條件下萌發率較高，pH7.0萌發率為93.3%，菌絲的生長和子囊孢子萌發以偏堿性條件為好，而分生孢子萌發以中性偏酸條件為好。

2.2.4濕度對孢子萌發的影響

表8結果表明，子囊孢子在相對濕度95%～99.5%和水滴中均可萌發，以在對照水滴中萌發最好，達91.7%，與其他處理均有顯著差異，相對濕度99.5%條件下的子囊孢子萌發率為15.7%，相對濕度90%以下子囊孢子不萌發。分生孢子在相對濕度75%～99.5%和水滴中均可萌發，以在對照水滴中萌發最好，達到97.3%，在99.5%的相對濕度下，萌發率43.3%，相對濕度70%時分生孢子不萌發，因此初春雨水較多的氣候條件有利于病害完成初侵染。

2.2.5營養對孢子萌發的影響

結果表明（圖2），尿素對子囊孢子萌發具有強烈的抑制作用。蒸餾水中，10.5h子囊孢子萌發率為93%，在供試的葡萄糖、葉片、果實、土壤不同濃度的營養成分對枸杞小黑梨孢孢子萌發具有一定的促進作用，子囊孢子萌發速率高于蒸餾水中，7.5h孢子萌發率即可達到90%。

枸杞小黑梨孢子囊孢子在不同的營養液中的萌發速率趨勢較一致，從子囊孢子在蒸餾水、葡萄糖（1：10）、葉片榨出液（1：20）3種處理中的萌發速度來看（圖3），在4.5～7.5h萌發最快，4.5h萌發率在30%左右，7.5h可達到80%以上，7.5～9h萌發變慢，9h以后萌發率不再增長。說明4.5～7.5h是子囊孢子萌發的最快時期，這與溫度、濕度等試驗中的結果一致。分生孢子的萌發速率與此相同。

3討論

深入研究病原菌的生物學特性及發病流行條件，可為病害防治提供較完善科學的理論依據。本研究結果表明，枸杞褐斑病發生后，造成大量的落葉落果，病原菌在落葉中可形成子囊殼和子囊孢子越冬，子囊孢子的萌發最適溫度比分生孢子萌發最適溫度低5℃，適宜于早春越冬后的子囊孢子的萌發和侵染，造成病害始發。在25℃，田間有露水、雨后天晴或灌溉后田間濕度大的條件下，分生孢子4.5h萌發率在30%左右，7.5h可達到80%，因此，在枸杞生長期，田間病害擴展蔓延迅速。分生孢子萌發溫度范圍為5～37℃，最適溫度為25℃，在35℃的高溫下，10.5h后，分生孢子也有9.3%可以萌發，并且研究發現中性偏堿環境下適宜枸杞褐斑病菌生長，我國枸杞多種植在北方高溫干旱地區，土壤多為鹽堿地，因此田問病原菌再侵染頻繁，病害持續時問長，蔓延擴展速度快。通過研究發現，枸杞小黑梨孢在甘肅省景泰縣主要以菌絲體及子囊殼在地表和病殘體上越冬，因此，在夏末冬初，清理田園，將病葉病果等病殘組織集中燒毀或深埋，減少來年初侵染源，是防治該病發生和擴散的重要措施。在枸杞栽培管理過程中要注意種植地的灌溉和通風情況，通過降低環境中的溫度和濕度來降低枸杞褐斑病的發病率，從而提高枸杞的產量和質量。總之，通過研究枸杞小黑梨孢的體外生物學特性，對該病害的后續研究以及田問防治提供了重要的參考。