不同種衣劑對華北大黑鰓金龜幼蟲的防治效果及解毒酶活性的影響

任美鳳 董晉明 李大琪 暢建武 郝曉娟 陸俊姣

關鍵詞華北大黑鰓金龜;種衣劑;防治效果;解毒酶;紅蕓豆

紅蕓豆，學名菜豆Phaseolus vulgaris L.，經濟價值較高，是山西小雜糧出口創匯的主要品種之一，每年出口量約3萬t，占中國紅蕓豆出口總量的40%以上。農業生產中，根腐病嚴重危害紅蕓豆種植。由于蠐螬為害損壞種子，咬食根系，加劇病原菌入侵，加重根腐病的發生，導致經濟效益受損，降低農民種植的積極性。加之全球氣候變暖及耕作模式的變化，導致地下害蟲蟲口基數加大，為害時期加長。如何科學、高效防控蠐螬是當前紅蕓豆生產中急需解決的關鍵問題。

華北大黑鰓金龜Holotrichia oblita是土棲性金龜子的優勢種之一，是華北旱作區重要的地下害蟲_，其幼蟲（蠐螬）取食發芽種子和根系，食性廣，為害重，為害時間長，防治非常困難。目前，生產中對蠐螬的防治主要采用農藥溝施、撒毒土、灌根、毒餌誘殺等方法，費時費工，勞動成本較高。防治藥劑主要是有機磷類、氨基甲酸酯類以及苯基吡唑類等傳統藥劑，如：克百威、甲拌磷、毒死蜱等，此類藥劑具有劇毒或高殘留，被限制使用或禁止使用，導致市場上用于防治蠐螬的藥劑比較缺乏。因此，急需精準的施藥方式和綠色、安全、高效的化學藥劑。

種子包衣靶向性強，農藥利用率高，保證有限的農藥成分集中作用于種子和根部，精準化防治蠐螬，減少農藥施用量，相比傳統防治方法省時省力。李進榮等研究發現，噻蟲嗪和吡蟲啉種衣劑對大豆田蠐螬具有75%左右的防效;劉煜財等研究表明氯蟲苯甲酰胺·噻蟲嗪種衣劑對花生田蠐螬具有較高防效，但由于紅蕓豆對多種藥劑敏感，目前尚無關于紅蕓豆田蠐螬防治藥劑的相關研究。本研究選取4種懸浮種衣劑，采用室內盆栽方法，研究其對紅蕓豆的安全性和對華北大黑鰓金龜幼蟲的防治效果，為其防治提供科學用藥參考;采用酶學動力法測定對其解毒酶的影響，為華北大黑鰓金龜幼蟲解毒機制的研究提供理論依據。

1材料與方法

1.1材料

供試昆蟲：華北大黑鰓金龜成蟲采自山西省汾陽市，室內飼養待其產卵，將卵放人裝滿滅菌土的培養皿中，保持土壤濕度15%左右，放于人工氣候箱內，在溫度（25±0.5）℃、光周期L//D=16h//8h的條件下飼養，待其孵化后，單頭飼養，選擇整齊一致的3齡幼蟲待用。

供試作物：紅蕓豆，品種為‘品金蕓3號，由山西省農業科學院品種資源研究所提供。

供試藥劑及儀器設備：50%氯蟲苯甲酰胺懸浮種衣劑（chlorantraniliprole）由美國杜邦公司提供;600 g/L吡蟲啉懸浮種衣劑（imidacloprid）由拜耳作物科學（中國）有限公司提供;40%溴酰·噻蟲嗪懸浮種衣劑（cyantraniliprole·thiamethoxam）（20%溴氰蟲酰胺，20%噻蟲嗪）由瑞士先正達作物保護有限公司提供;50%吡蟲·硫雙威懸浮種衣劑（imida-cloprid·thiodicarb）（37.5%硫雙威，12.5%吡蟲啉）由江蘇龍燈化學有限公司提供;十二烷基硫酸鈉、a-萘酚、固藍B鹽、a-乙酸萘酯、丙酮、還原性谷胱甘肽、1-2，4-二硝基苯、考馬斯亮藍G-250等購于生物工程（上海）股份有限公司。所用設備主要是synergy HT多功能酶標儀，美國佰騰儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1供試藥劑的防蟲效果及種子被害情況評價

播種前，按各藥劑的推薦使用劑量確定包衣量，本試驗中50%氯蟲苯甲酰胺FSC、600 g/L吡蟲啉FSC、40%溴酰·噻蟲嗪FSC、50 9/6吡蟲·硫雙威FSC的包衣量分別為3、4、3、4 mL/kg。先將各個藥劑按劑量調成漿狀液，然后將紅蕓豆種子和藥液倒入塑料袋中充分翻拌，待種子均勻著藥后，倒出攤開置于通風處，晾干后備用。空白對照（CK）用清水拌種，方法同上。

試驗共設5個處理，3次重復，每個重復10盆（11.5cm×17cm×12cm）。每盆播種大小均勻種子3粒，播深4～5cm，室溫栽培，播時每盆接華北大黑鰓金龜3齡幼蟲1頭。播種30d后，調查各處理種子被害情況、活蟲數量，并測量豆苗的株高、根長、鮮重、干重等。被害情況分級標準如下：0級，完好無損;1級，種子被咬食5 9/6以下;2級，5%≤種子被咬食<10%;3級，10%≤種子被咬食<25%;4級，25%≤種子被咬食<50%;5級，50%≤種子被咬食。根據以下公式計算種子被害指數、蟲口存活率和防治效果。

種子被害指數=∑（各級被害株數×相對級值）/（調查總株數×5）×100;

蟲口存活率一處理后蟲口數/處理前蟲口數×100%;

防治效果=（對照蟲口存活率-藥劑處理蟲口存活率）/對照蟲口存活率×100%。

1.2.2供試藥劑對華北大黑鰓金龜幼蟲谷胱甘肽

S-轉移酶（GSTs）活性的影響

試驗共設5個處理，將不同包衣處理的種子置于牙簽盒內（每盒3顆種子）并放人相同體積的土壤（約占牙簽盒體積2/3），單頭飼養華北大黑鰓金龜幼蟲，分別于48、72、96h后收集試蟲，用去離子水清洗，吸水紙吸干水分，制備酶源。

取處理后試蟲5頭，稱重，置于預冷的研缽中，按照1：2（rn/V）比例加入預冷的pH為7.0的66 mmol/L磷酸緩沖液，冰浴條件下研磨勻漿，于4℃，12 000 r/min冷凍離心20 min，用紗布過濾得上清液，再4℃，12 000 r/min冷凍離心10 min，取上清液備用，用66 mmol/L pH 7.0的磷酸緩沖液稀釋50倍作為待測酶液。

參照Habig等的方法并加以改進，取100 vL酶液，加入1.3 mL 66 mmol/L的磷酸緩沖液（pH7.0），加入150μL 50 mmol/L還原性谷胱甘肽溶液，50 μL O.03 mol/L CDNB，放入24孔板中，迅速混勻后于340 nm測出5min內每隔1min的OD值變化;對照組不加入酶液，緩沖液加1.4mL，其他試劑體積不變，如前述測定OD值的變化。依照公式計算酶活力。

1.2.3供試藥劑對華北大黑鰓金龜幼蟲羧酸酯酶（CarE）活性的影響

試驗處理如1.2.2，取處理后試蟲5頭，稱重，置于預冷的研缽中，按照1：2（m/V）比例加入預冷的pH為7.0的0.04 mol/L磷酸緩沖液，冰浴條件下研磨勻漿，于4℃，12 000 r/min冷凍離心20 min，用紗布過濾得上清液，再4℃，12000 r/min冷凍離心10min，取上清液備用，用0.04mol/L pH 7.0的磷酸緩沖液稀釋50倍作為待測酶液。

參照Van Aspern等的方法并加以改進，取0.5mL酶源，2.5 mL 3×10 a一乙酸萘酯，30。C恒溫水浴30 min后，加入0.5 mL顯色劑，于室溫靜置30 min，在波長600nm下測定OD值。以a-萘酚制作標準曲線，根據酶源蛋白含量測定結果，計算CarE活力。

1.2.4蛋白含量測定

采用考馬斯亮藍（G-250）法進行測定。

1.3數據處理

采用SPSS 21.0對數據統計分析，處理問差異采用單因素方差分析，用Duncan氏新復極差法進行差異顯著性分析。

2結果與分析

2.1不同種衣劑對紅蕓豆出苗及生長的影響

4種種衣劑均對紅蕓豆安全，且顯著提高了出苗率、根鮮重和根干重（表1）。與對照相比，出苗率均顯著增加40百分點左右;根鮮重顯著增加50.00%～135.29%，50%吡蟲·硫雙威FSC和600 g/L吡蟲啉FSC增幅最高，為135.29%，50%氯蟲苯甲酰胺FSC次之，為88.24%，40%溴酰·噻蟲嗪FSC增幅較低，為50.00%;根干重顯著增加66.67%～133.33%，50%吡蟲·硫雙威FSC增幅最大，為133.33%，600 g/L吡蟲啉FSC和50%氯蟲苯甲酰胺FSC次之，均為100%，40%溴酰·噻蟲嗪FSC增幅較低，為66.67%。600 g/L吡蟲啉FSC和50%吡蟲·硫雙威FSC可顯著提高紅蕓豆的莖鮮重，其他2種種衣劑對其無顯著性影響。50%吡蟲·硫雙威FSC和40%溴酰·噻蟲嗪FSC可顯著提高紅蕓豆的株高，其他2種種衣劑對其無顯著性影響。

2.2不同種衣劑的防治效果及保種效果

如表2所示，40%溴酰·噻蟲嗪FSC防治效果最好，為74.81%，50%氯蟲苯甲酰胺FSC次之，為60.65%，二者差異不顯著;50%吡蟲·硫雙威FSC和600 g/L吡蟲啉FSC防治效果較低，分別為29.32%、19.23%，其中50%吡蟲·硫雙威FSC與50%氯蟲苯甲酰胺FSC差異不顯著。

2.3不同種衣劑對華北大黑鰓金龜幼蟲解毒酶活性的影響

2.3.1不同種衣劑對華北大黑鰓金龜幼蟲谷胱甘肽-轉移酶（GSTs）活性的影響

如圖1所示，經50%氯蟲苯甲酰胺FSC和40%溴酰·噻蟲嗪FSC處理48 h時，華北大黑鰓金龜幼蟲體內谷胱甘肽S-轉移酶活力顯著低于對照，72、96h后酶活逐漸上升，與對照差異不顯著。經4種種衣劑對紅蕓豆的莖干重均無顯著影響。幅為70.18%～74.92%。600 g/L吡蟲啉FSC種子被害指數最低，為6.96，40%溴酰·噻蟲嗪FSC種子被害指數次之，為8.25，二者差異不顯著;50%吡蟲·硫雙威FSC和50%氯蟲苯甲酰胺FSC次之，分別為11.19、11.70，但與40%溴酰·噻蟲嗪FSC差異不顯著。

4種種衣劑都可顯著抑制華北大黑鰓金龜幼蟲的生長，平均體重減輕0.07～0.21g，而空白對照體重平均增加0.14g。

4種種衣劑顯著降低紅蕓豆種子被害指數，降600g/L吡蟲啉FSC處理48 h時GSTs酶活顯著低于對照，72、96 h時逐漸提升，96 h時顯著高于對照。經50%吡蟲·硫雙威FSC處理48 h和72 h，GSTs酶活力與對照無顯著差異;96 h時顯著高于對照。結果說明：40%溴酰·噻蟲嗪FSC、50%氯蟲苯甲酰胺FSC和600 g/L吡蟲啉FSC，在48 h均可顯著降低谷胱甘肽S-轉移酶酶活以起到毒殺作用，但隨著處理時間的延長，谷胱甘肽S-轉移酶活力均逐漸升高，且600g/L吡蟲啉FSC對其誘導作用較顯著;600g/L吡蟲啉FSC和50%吡蟲·硫雙威FSC處理96h均可誘導華北大黑鰓金龜幼蟲提高谷胱甘肽S-轉移酶酶活以降解殺蟲劑增加存活率。

2.3.2不同種衣劑對華北大黑鰓金龜幼蟲羧酸酯酶（CarE）活性的影響

如圖2所示，4種藥劑處理48h后華北大黑鰓金龜幼蟲羧酸酯酶活性均顯著高于對照;處理72h后，各處理CarE酶活性均顯著低于對照;處理96h后CarE酶活性均大于等于對照，其中50%氯蟲苯甲酰胺FSC、600 g/L吡蟲啉FSC顯著高于對照，50%吡蟲·硫雙威FSC、40%溴酰·噻蟲嗪FSC與對照差異不顯著。結果說明：處理48、72h后，4種種衣劑對羧酸酯酶活性表現為先激活后抑制;96h時50%吡蟲·硫雙威FSC和40%溴酰·噻蟲嗪FSC對羧酸酯酶活性作用不明顯，600g/L吡蟲啉FSC和50%氯蟲苯甲酰胺FSC對其有激活作用。酶活的波浪形變化曲線表明，華北大黑鰓金龜幼蟲動態調整羧酸酯酶酶活以抵抗4種種衣劑的不良脅迫作用。

3討論

目前，國內外關于紅蕓豆的研究主要集中于營養價值開發和品種選育，種衣劑的研究甚少。高效種衣劑推廣應用的前提和關鍵是對作物的安全性，本研究結果表明，4種種衣劑均對紅蕓豆安全，能顯著提高其出苗率、根鮮重和根干重。段強等研究發現吡蟲啉種衣劑促進玉米根長、根數等增加;尚棟亮等使用40%溴酰·噻蟲嗪FSC對玉米種子包衣，發現其促進玉米生長，對幼苗生長安全無害;何發林等經研究證實2.40、3.20g/kg種子劑量的氯蟲苯甲酰胺對花生出苗安全，以上研究均與本研究結果一致。

王猛等研究發現，溴氰蟲酰胺對甜菜夜蛾、玉米螟和小地老虎的毒力比氯蟲苯甲酰胺高，與噻蟲嗪復配后增加殺蟲譜，提高防蟲效果，與本研究結果相似，40%溴酰·噻蟲嗪FSC防效最高，為74.81%，50%氯蟲苯甲酰胺FSC次之，為60.65%。何發林等經室內盆栽和大田試驗證實了高劑量氯蟲苯甲酰胺對玉米和花生地下害蟲的防效高于吡蟲啉，在本研究中也得到驗證，50%氯蟲苯甲酰胺FSC防治效果顯著高于吡蟲啉。復配種衣劑的防治效果高于單劑，與前人研究結果一致，50%吡蟲·硫雙威FSC防效高于600g/L吡蟲啉FSC，并且能夠有效減緩抗性的發展進程。因此在生產中應首選復配制劑防治華北大黑鰓金龜幼蟲。本研究中，4種種衣劑對華北大黑鰓金龜幼蟲的防治效果較其他研究低，可能是因為試驗用蟲蟲齡較大，抵抗力較強，需在田間進行進一步試驗。

近年來，山西省紅蕓豆根腐病發生較為嚴重，分析其原因，主要是由于連茬種植，導致病原菌數量增多，其次是由于土壤中地下害蟲數量逐年累積，咬食種子及根部，增加病原菌入侵機會，進而增加根腐病發病率，因此，降低蠐螬為害率對防治根腐病具有重要意義。本研究中，4種種衣劑顯著降低紅蕓豆種子被害指數，究其原因可能是由于吡蟲啉對蠐螬有驅避作用或者氯蟲苯甲酰胺和溴氰蟲酰胺作用于魚尼丁受體，破壞昆蟲的肌肉收縮功能，導致其出現拒食現象，進而降低對種子的危害程度。建議在蠐螬發生嚴重的地塊選用40%溴酰·噻蟲嗪FSC和50%氯蟲苯甲酰胺FSC 2種種衣劑，在發生較輕的地方選擇50%吡蟲·硫雙威FSC和600g/L吡蟲啉FSC 2種種衣劑，降低蠐螬為害率，減少病原菌入侵機會。

當昆蟲受到化學藥劑脅迫時，會調節體內的解毒酶活性來抵御逆境脅迫毒害，而使其存活。何發林等發現，溴氰蟲酰胺可提高小地老虎體內谷胱甘肽S-轉移酶的活性，但對羧酸酯酶活性表現為前期誘導后期抑制，而余慧靈等報道溴氰蟲酰胺對甜菜夜蛾幼蟲體內解毒酶活性有不同程度的抑制作用。本研究中，4種種衣劑對兩種解毒酶的影響也不相同。40%溴酰·噻蟲嗪FSC、50%氯蟲苯甲酰胺FSC和600g/L吡蟲啉FSC，在48 h對谷胱甘肽S-轉移酶活力的影響均表現為抑制作用，隨著處理時間的延長，96 h時600g/L吡蟲啉FSC和50%吡蟲·硫雙威FSC誘導其活性顯著增加。處理48、72h后，4種種衣劑對羧酸酯酶活性表現為先激活后抑制;96h時50%吡蟲·硫雙威和40%溴酰·噻蟲嗪FSC對羧酸酯酶活性作用不明顯，600g/L吡蟲啉FSC和50%氯蟲苯甲酰胺FSC對其有激活作用。說明不同藥劑可能由于作用方式、作用機理不同，而對同種昆蟲相同或不同解毒酶有不同影響，昆蟲調節不同解毒酶應對不同藥劑脅迫。因此，在生產中用藥時一定要輪換使用，減緩抗性的產生，提高防效。

綜上所述，4種種衣劑可顯著降低種子被害指數，增加出苗率，促進植物根系生長，并且40%溴酰·噻蟲嗪FSC和50%氯蟲苯甲酰胺FSC對華北大黑鰓金龜幼蟲具有良好的防治效果。建議在紅蕓豆生產中根據蟲情針對性推廣應用，并與其他藥劑輪換使用，以期為根腐病綜合防控提供技術參考，為紅蕓豆高效種植提供技術支撐。