遼寧省北鎮(zhèn)市葡萄葉斑病的病原鑒定

劉梅 王彩霞 燕繼曄 賈靜怡 李興紅

關(guān)鍵詞葡萄;葉斑病;多基因系統(tǒng)發(fā)育;平頭炭疽菌

葡萄為葡萄科葡萄屬落葉藤本植物，原產(chǎn)于歐洲和亞洲西部，是世界上種植面積最大的水果之一。我國葡萄產(chǎn)量和種植面積長期位居世界前列。在葡萄栽培過程中，有時(shí)會在葉片上出現(xiàn)由真菌侵染形成的大小形狀不一的斑點(diǎn)，具有傳染性，造成葉片局部壞死甚至整片枯黃脫落，對葡萄生產(chǎn)造成不利影響。

目前國內(nèi)外已經(jīng)報(bào)道的葡萄真菌性葉斑病主要有褐紋病、大褐斑病、小褐斑病、輪斑病、殼針孢葉斑病、環(huán)紋葉枯病、假尾孢葉斑病和尾孢葉斑病、角斑葉焦病、葉枯病、黑痣病、枝孢葉斑病，Neopestalotiopsis vitis、Cladosporium hebeiense引起的葡萄葉斑病，以及由鏈格孢Alternaria alternata、葡萄鏈格孢A viniferae和喬木鏈格孢A.arborescens引起的葡萄葉斑病等。近年來遼寧北鎮(zhèn)葡萄上出現(xiàn)葉斑病癥狀，表現(xiàn)為葉上出現(xiàn)圓形或橢圓形小黑斑，病斑周圍褪綠變黃，影響葉片功能，進(jìn)而影響果實(shí)產(chǎn)量和品質(zhì)。

為明確引起該病害的病原菌，對病樣進(jìn)行分離培養(yǎng)，采用多基因系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)合形態(tài)學(xué)特征對分離得到的病原菌進(jìn)行鑒定，以期為該葡萄葉斑病的發(fā)生和防治提供參考。

1材料與方法

1.1材料

供試病樣及寄主：從遼寧北鎮(zhèn)采集出現(xiàn)圓形或橢圓形小型黑色病斑、周圍出現(xiàn)褪綠變黃的葡萄葉斑病病葉15片，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行組織分離。致病性測定所用‘夏黑葡萄葉片采自北京葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研發(fā)中心。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20g、瓊脂15～18g，加水定容至1000mL，121℃高壓蒸汽滅菌20min。

試劑及儀器：十六烷基三甲基溴化銨（cetyltri-methylammoniumbromide，CTAB），美國Amresco公司;2×Taq Master Mix和DNA Marker，北京博邁德基因技術(shù)有限公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。Axio Imager Z2顯微鏡，德國Carl Zeiss公司;Bio-Rad Gel DocTM XR+凝膠成像儀、C1000 TouchTMThermal Cycler PCR儀，美國Bio-Rad公司;Ep-pendorf AG 5424離心機(jī)，德國Eppendorf公司。

1.2方法

1.2.1病原菌的分離與純化

采用常規(guī)組織分離法對具有典型癥狀的葉片進(jìn)行分離。首先在病健交界處剪取邊長為5mm的方形組織，用75%乙醇消毒30 s，無菌水清洗3次，晾干后置于PDA平板上，將培養(yǎng)皿置于25℃、L//D=12 h//12h條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，采用單孢分離法進(jìn)行菌種純化，將純化菌株編號為JzB330152，并在4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2病原菌的分子生物學(xué)鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

采用CTAB法提取菌株的基因組DNA。分別利用rDNA轉(zhuǎn)錄問隔區(qū)ITS通用引物ITS-4（5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3）/ITS-5（5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3）、3-磷酸甘油醛脫氫酶GAPDH基因的引物GDF（5'-GC-CGTCAACGAATIGA-3）幾丁質(zhì)合酶CHS-1基因的引物CHS-79F（5，-TGGGGCAAG-GATGCTTGGAAGAAG-3）CHS-345R（5-TG-GAAGAACCATCTGTGAGAGTTG-3）、肌動蛋白ACT基因的引物ACT-512F（5，-ATGTG-CAAGGCCGGTTTCGC-3）/ACT-783R（5-TAC-GAGTCCTTCTGGCCCAT-3）微管蛋白TUB2基因的引物BT-2F（5，-GTBCACCTYCAR-ACCGGYCARTG-3'）/BT-4R（5-CCRGAYTGRC-CRAARACRAAGTTGTC-3）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成，PCR產(chǎn)物送至北京博邁德基因技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。在NCBI上對測序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對分析，在GenBank中下載相關(guān)參考序列，利用MAFF）對所有序列進(jìn)行比對，利用BioEdit 7.0.9.0軟件進(jìn)行多基因序列整合，而后利用ALTER軟件將文件格式轉(zhuǎn)換成nexus格式。最后將序列載人PAUP 4.0b10軟件中，用最大簡約法（maximumparsimony，MP）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹并進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.2.3形態(tài)學(xué)觀察

將純化后的菌株在PDA平板上于28℃、L//D=12 h//12h的條件下培養(yǎng)7～10 d，觀察記錄菌落形態(tài)如形狀、顏色、質(zhì)地等。在顯微鏡下觀察分生孢子、分生孢子盤的形態(tài)特征并測量分生孢子大小，共測量30個(gè)分生孢子。

1.2.4致病性測定

選取健康成熟的‘夏黑葡萄葉片，用1%NaCl0表面消毒30 s，無菌水清洗3次，吹干備用。將純化后的菌株在PDA平板上培養(yǎng)7d，用血球計(jì)數(shù)法配制濃度為1×10個(gè)/mL的孢子懸浮液備用。采用滴接法對離體葉片分別進(jìn)行刺傷和無傷接種。每片葉4個(gè)接種點(diǎn)，于主葉脈兩側(cè)各2個(gè)且對稱，一側(cè)刺傷接種，另一側(cè)無傷接種，每點(diǎn)接種孢子懸浮液20μL，共處理9片葉，重復(fù)3次，以無菌水為空白對照。接種后將葉片置于25℃、相對濕度90%下進(jìn)行黑暗培養(yǎng)24h，之后在相對濕度65%、光周期L//D=12h//12h條件下培養(yǎng)。觀察并記錄葉片的發(fā)病情況，接種部位出現(xiàn)褐色病斑即為開始發(fā)病，直至出現(xiàn)與田間相似的癥狀時(shí)對病斑再次進(jìn)行組織分離，觀察分離物與接種菌株的形態(tài)特征，完成柯赫氏法則驗(yàn)證。

2結(jié)果與分析

2.1病原菌的分子生物學(xué)鑒定

利用ITS、GAPDH、CHS-1、ACT與TUB2共5個(gè)基因序列對所得菌株進(jìn)行PCR特異性擴(kuò)增，分別得到長度為528、290、249、272 bp和497 bp的片段，以Colletotrichum lindemuthianum CBS144.31作為外群經(jīng)MP法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示：JZB330152與平頭炭疽菌Colletotrichum truncatum（CBS 151.35）聚在同一支上，自展支持率為100%（圖1）。

2.2病原菌的形態(tài)學(xué)特征

PDA培養(yǎng)基上病原菌菌落圓形，邊緣整齊，菌絲較稀疏，緊貼培養(yǎng)基生長，初期菌落邊緣為白色，中心為淺灰色，后期菌落顏色變?yōu)樯詈稚?分生孢子盤黑色堆狀突起;分生孢子呈無色，無分隔，新月或鐮刀形，兩頭鈍尖，大小為（15.32～28.51）μm×（3.33～6.62）μm。依據(jù)形態(tài)鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析，將葡萄葉斑病的病原菌鑒定為平頭炭疽菌Colleto-trichum truncatum（圖2）。

2.3致病性測定

無傷和刺傷接種‘夏黑葡萄葉片，接種后3d均開始發(fā)病，7d病斑逐漸向周邊擴(kuò)展，病斑顏色變深，成暗褐色。對照葉片未發(fā)病。對發(fā)病葉片再次進(jìn)行組織分離，分離物與原始分離菌株一致，完成柯赫氏法則驗(yàn)證（圖3）。

3討論

本研究對采自遼寧省北鎮(zhèn)市的感病葡萄葉片進(jìn)行了病原菌的分離純化、形態(tài)鑒定、致病性測定及柯赫氏法則驗(yàn)證。并對病原菌的ITS、GAPDH、CHS-1、ACT與TUB2基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果顯示，病原菌與平頭炭疽菌Colletotrichum trun-catum模式菌株CBS 151.35聚在同一支上，且自展支持率為100%，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征將引起葡萄葉斑病的病原菌鑒定為C truncatum。

在葡萄的栽培中，炭疽病是一種重要的常見病害，主要為害葡萄果實(shí)，一般造成葡萄減產(chǎn)10%～20%，日本、澳大利亞等國家報(bào)道引起葡萄果實(shí)炭疽病的病原菌為膠孢炭疽菌C gloeosporioides和（或）尖孢炭疽菌C acutatum，國內(nèi)報(bào)道引起葡萄炭疽病的病原菌有膠孢炭疽菌、C viniferum、C fructicola以及C aenigma和C hebeiense，2016年筆者在湖北發(fā)現(xiàn)引起‘紅地球葡萄嫩梢枯死。目前在我國，平頭炭疽菌可危害番茄、火龍果、南瓜等，但平頭炭疽菌侵染葡萄僅在瑞士有過報(bào)道，我國尚未見相關(guān)的研究報(bào)道。

據(jù)調(diào)查，在北鎮(zhèn)由炭疽病菌引起的葡萄葉斑病在夏季雨季過后發(fā)病嚴(yán)重，說明炭疽病的發(fā)生與雨水關(guān)系密切，高溫高濕的環(huán)境有利用于病原菌的生長，因此在病害易發(fā)生的季節(jié)應(yīng)加強(qiáng)果園管理，及時(shí)清除病葉，避免通風(fēng)不良、澆水過多的情況發(fā)生，病害發(fā)生嚴(yán)重時(shí)，需選擇合適的殺菌劑進(jìn)行防治。Greer等的研究顯示，膠孢炭疽菌和尖孢炭疽菌在侵染特性和對殺菌劑的敏感性方面表現(xiàn)不同。尖孢炭疽菌侵染速度快于膠孢炭疽菌，并且對克菌丹、三環(huán)唑的敏感性要顯著高于尖孢炭疽菌。而膠孢炭疽菌對苯菌靈的敏感性要高于尖孢炭疽菌。鄧維萍等的報(bào)道也證實(shí)了這點(diǎn)。因此需對平頭炭疽菌對殺菌劑的敏感性進(jìn)行測定，以篩選出高效、安全的藥劑投入到葡萄葉斑病的防治中，結(jié)合農(nóng)業(yè)栽培、生物防控等多種措施，構(gòu)建完善的綜合防控技術(shù)體系，防控病害的進(jìn)一步發(fā)生和蔓延。