軟棗獼猴桃種質資源潰瘍病抗性鑒定方法的建立與評價

溫欣 秦紅艷 艾軍 王月 韓先焱 李昌禹

關鍵詞軟棗獼猴桃;抗性評價;細菌性潰瘍病

獼猴桃潰瘍病是由丁香假單胞菌獼猴桃致病變引起的嚴重的細菌性病害。因其蔓延速度快、發病范圍廣和致病性強等特點，成為危害獼猴桃植株生長、限制獼猴桃產業發展的主要病害。病原菌主要從氣孔、皮孔及傷口等孔口侵入，危害樹干、枝條、葉片及花，引起樹體枝干潰爛，樹勢衰弱，葉片萎蔫和花器受損，嚴重的可致全園獼猴桃樹體死亡。研究結果表明，獼猴桃不同種之問抗性不同，軟棗獼猴桃Actinidia arguta、毛花獼猴桃A eriantha Benth.對潰瘍病抗性明顯強于中華獼猴桃A chinensisPlanch和美味獼猴桃A.chinensis var.deliciosa，但具體的評價結果受環境和評價手段的不同而有所差異。軟棗獼猴桃是獼猴桃屬的落葉藤本植物，對潰瘍病抗性較強，至今未見果園大面積發病現象。但軟棗獼猴桃不同種質資源問是否存在差異，以及種內不同種質資源的抗性變異狀況等方面未見報道。本試驗以51份軟棗獼猴桃種質資源為材料，以中華獼猴桃中的高感品種‘紅陽、美味獼猴桃中的中抗品種‘徐香為對照，采用離體半木質化枝條接種和功能葉片接種進行抗病性評價，研究不同軟棗獼猴桃種質資源對潰瘍病的抗性，明確不同種質問的抗性差異，篩選抗病性較強的軟棗獼猴桃種質，為提高獼猴桃抗病性及抗病品種選育提供理論依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試植物

51份軟棗獼猴桃資源均取自中國農業科學院特產研究所軟棗獼猴桃資源圃。美味獼猴桃‘徐香和中華獼猴桃‘紅陽為盆栽材料。選取健康、生長勢中庸且均勻一致的半木質化枝條和功能葉片作為試驗材料。

1.1.2供試菌種

丁香假單胞菌獼猴桃致病變種Pseudomonassyringae pv.actinidiae（Psa）菌株PSAM228為強致病力菌株，為西北農林科技大學果樹病害病原生物學及綜合防治研究團隊實驗室保存，由西北農林科技大學高小寧老師所贈。

1.2試驗方法

1.2.1 PSAM228的GFPuv標記

參照黃其玲等的方法，略有改進。采用CaCle轉化法對PSAM228菌株進行綠色熒光蛋白（GFP）標記，標記的PSAM228菌株（后文稱GFPuv標記菌株）可在485nm紫外激發光下通過535nm濾光片觀察到潰瘍病菌在離體材料中的侵染狀態。

1.2.2菌液最適培養時間篩選

用接種環蘸取PSAM228菌液在NA培養基上劃線，然后置于（25±1）℃培養箱中暗培養2d。挑取單菌落于LB液體培養基中，25℃分別振蕩培養12、18h和24h。在設定的培養時問吸取菌液，稀釋后在NA培養基上涂板，置于（25±1）℃培養箱暗培養16h左右，用平板計數法計算菌液濃度。

1.2.3人工接種和抗性評價

取軟棗獼猴桃不同種質資源健康、生長勢中庸且均勻一致的半木質化枝條和功能葉片，先后用蒸餾水和無菌水洗凈備用。參考黃其玲的接種方法并結合本試驗加以改進。

1.2.3.1半木質化離體枝條接種

枝條采用刻傷接種方法。將枝條剪成約15cm長，用無菌解剖刀橫切一個小口深至木質部，滴加20μL菌液后附濕潤的無菌棉保濕。2018年采用沒有GFPuv標記的PSAM228菌液;2019年采用GF-Puv標記的PSAM228菌液。

1.2.3.2離體葉片接種

2018年采用針刺葉片法接種。用無菌接種針在葉片上每隔1cm刺一個小孔（避開葉脈），布滿整個葉片，并均勻地涂上沒有GFPuv標記的PSAM228菌液，將葉柄處用濕潤的無菌棉包好。

1.2.3.3離體葉脈接種

2019年采用葉脈注射法接種。即用無菌注射器從葉片基部的葉柄處注入GFPuv標記的PSAM228菌液20μL。

上述接種方法使用的菌液濃度均為10cfu/mL。每份資源分別接種5個枝條和5片葉片，重復3次，接菌后的枝條和葉片放人有濕潤無菌濾紙的無菌培養皿中，在（18±1）℃的培養箱中培養，定期觀察枝條韌皮部顏色變化和病斑長度、葉片病斑情況。接種后21d調查發病情況，刮除枝條感病部位的表皮，分別測量半木質化枝條病斑長度、葉片病斑面積和病菌沿主葉脈發展的長度。離體葉脈接種的葉片在485nm紫外光激發下，通過535nm濾光片可觀察到GFPuv標記菌株發出的熒光，通過熒光可方便地測量病菌延展長度。離體枝條和葉片感病情況分為7級，如表1所示。

病情指數=∑（病枝數×病級值）/（調查總枝數×最高級值）×100。

參照石志軍等的方法通過病情指數確定抗性。評價標準為：高抗，病情指數≤10;中抗，10<病情指數≤30;感病，30<病情指數≤50;中感，50<病情指數≤70;高感，病情指數>70。

1.2.4數據分析

應用Excel 2013、SAS 9.2軟件進行數據分析。

2結果與分析

2.1菌液最適培養時間

利用平板計數法得到不同培養時間菌液的濃度，12h菌液濃度為10cfu/mL左右，18h菌液濃度為10cfu/mL左右，24h菌液濃度為10cfu/mL左右。接菌濃度以10cfu/mL為宜，因此18h為較佳培養時間。

2.2不同軟棗獼猴桃種質資源抗性鑒定與評價

通過半木質化離體枝條和成熟葉片接種，可以看出不同抗性種質半木質化枝條發病后病斑大小有明顯差異（圖1），在軟棗獼猴桃種質中‘桓優1號發病最嚴重，但病斑長度與中華獼猴桃‘紅陽病斑長度差別較大;部分種質對潰瘍病接近免疫，基本無發病現象，如雌性品種‘蘋綠和雄性品種‘綠王‘61-1等。葉片針刺接種后21d在接種部位可觀察到病斑，且不同抗性種質病斑面積有差異。葉脈接種后發現有些葉片表面無明顯發病現象，但在波長485nm紫外光激發下，葉脈處可見明顯的帶有綠色熒光病菌侵染現象（圖2），且不同抗性種質資源葉脈發病情況有明顯差異，說明使用熒光標記的菌液接種使試驗結果更加準確。但在紫外光激發下，接種GFPuv標記的PSAM228菌液的半木質化離體枝條未能清晰看見綠色熒光，因此仍以測量半木質化枝條發病的病斑長度為測量指標。