生豬廢水處理和磷回收工藝中抗生素和耐藥細菌的削減特征

王蕾，黃栩

（1. 廈門華廈學院環境與公共健康學院，福建 廈門 361024；2. 中國科學院城市環境研究所，福建 廈門 361021）

我國的城鎮化進程推動著現代農業養殖向規模化和標準化發展。然而規?；B殖條件使得病原細菌更容易在養殖動物間相互傳染，給動物疾病預防和治療帶來困難。為了保證預防和治療效果，養殖戶經常加大抗生素用量或者交叉使用抗生素?？股貫E用造成的環境影響包括：1）大部分抗生素未能被動物體完全轉化而隨著排泄物排出進入農田和魚塘等[1]；2）動物腸道在抗生素誘導作用下會導致細菌耐藥，并能通過質粒水平轉移等方式將一些耐藥基因轉移給受納環境中的土著微生物[2]。這些腸道耐藥病原菌通過施肥和澆灌附生于農作物[3]，并可能流入市場給公眾健康帶來巨大的威脅。面對細菌耐藥事件頻發，規模化養殖場一方面需要加強獸藥管理，另一方面需要優化廢水處理工藝條件，減少腸道耐藥細菌的環境釋放。因此，研究生豬養殖廢水處理過程抗生素和耐藥細菌變化趨勢對于保護區域生態環境和居民健康具有重要科學意義。

規?；B殖場動物的排泄物，通常先經過固液分離之后，固體部分堆肥還田[4]，廢水部分經厭氧消解[5-6]，然后通過生物氧化塘、人工濕地[7-8]和土壤滲濾等生態技術處理后排放。近年來，生豬廢水中資源回收技術受到更多青睞，其中包括厭氧產沼[9]和磷酸銨鎂（MAP）法磷回收[10]。生豬廢水含有高濃度的氮磷元素，而磷素具有不可再生性，從生豬廢水回收磷素資源既可降低環境水體富營養化風險，獲得的MAP可用作緩釋肥料具有較高經濟價值[11]。目前，已有一些研究開展了上述廢棄物處理環節中抗生素、病原菌和抗性基因的變化特征研究[2,5]，其中單個環節研究較多，兩個或者多個環節組合研究較少，堆肥和厭氧消解研究較多，其他環節特別磷回收工藝研究較少。因此，本文選擇廈門市翔安區某生豬養殖場，根據其現有養殖廢水處理設施，選擇厭氧消化池、氧化池、磷回收流化床和人工濕地為取樣環節。通過對養殖廢水處理和資源化設施中常規水質指標、抗生素、耐藥細菌削減規律的調查和分析，為養殖場耐藥細菌控制的工藝強化和工藝組合措施的改進提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和預處理

樣品于2017年夏采集自廈門市翔安區中等規模生豬養殖場，該養殖場生豬常年存欄量約3 000頭，日廢水產生量約60 m3/d，所設廢水處理設施除了常規的厭氧消化池（anaerobic digester，AD）和氧化池（oxidation pond，OP）之外，還專門配備一套磷酸銨鎂（MAP）磷回收流化床裝置（fluidized bed，FB），日處理量12 m3/d。實驗分別采集了養殖廢水原水（OW）以及厭氧消化池、氧化池和流化床的出水樣品，及時運送到實驗室進行預處理。除此之外，運送取自氧化池的廢水回實驗室，在溫室條件下，以穩定運行的垂直潛流人工濕地（CW）小試裝置（水力負荷10 cm/d）進行為期1個月的廢水處理，期間采集出水樣品。部分水樣放置于4 ℃，用于水質分析、抗生素檢測和耐藥菌計數等常規檢測，1～2天內完成；另有部分水樣經過離心收集沉淀，放置于-20 ℃，用于DNA提取和微生物群落的高通量測序。實驗涉及的采樣工藝節點示意圖參考圖1。

1.2 水質分析

廢水的pH值通過專門的pH值探頭檢測獲得。水質參數包括NH4+-N、TP、TN和COD等的測定方法參考《水和廢水監測分析方法（第四版）》。其中測試NH4+-N時先將水樣過濾，用于TP、TN檢測的水樣不過濾需消解，分別添加專有試劑，用紫外分光光度計檢測。用于COD檢測的水樣不過濾，添加試劑消解后用COD快速檢測儀檢測。

1.3 抗生素提取和檢測

本研究選擇四環素類、喹諾酮類和磺胺類抗生素中的代表，結合養殖場抗生素使用情況，最后選定OTC、CIP和SM2為目標抗生素。

抗生素提取方法：取50 ml的水樣加入0.1 g Na2EDTA，用鹽酸調節pH至3.0，準備固相萃取。Oasis HLB固相萃取小柱（6 mL，200 mg）在使用前依次用丙酮、甲醇和0.5%甲酸水溶液各6 mL預處理。然后將上述水樣以10 mL/min左右的速度過柱，再用6.0 mL 0.5%甲酸水溶液沖淋。抽真空干燥30 min后用6.0 mL的甲醇將目標化合物洗脫到氮吹管中，用溫和的氮氣流將甲醇吹干。最后用1.0 mL 20%的甲醇水溶液定容，定容后溶液用0.45 μm有機濾膜過濾，4 ℃保存等待上機。

1.4 耐藥菌計數

配制LB和麥康凱固體培養基，往這兩種培養基里添加三種不同的抗生素：CIP（8 μg/mL）、OTC（16 μg/mL）和SM2（256 μg/mL），同時以不加抗生素為對照，制備不同的選擇培養基。抗生素濃度參考抗微生物藥物敏感性試驗執行標準（CLSI 2014）中對各種抗生素微生物耐藥水平的認定。

將上述采集的水樣用0.9%的生理鹽水稀釋成不同的濃度梯度，然后取100 μL涂布于上述平板，28 ℃培養2天后，選菌落數適宜的平板進行計數。在LB培養基上生長的細菌代表總可培養細菌；麥康凱培養基上生長的細菌代表總可培養陰性菌，其中紅色菌落主要由大腸埃希氏菌和糞鏈球菌組成，無色菌落由奇異變形桿菌、鼠傷寒沙門氏菌和宋內氏志賀氏菌組成。

1.5 微生物群落分析

DNA提取：水樣用0.2 μm硝酸纖維濾膜過濾后用E.Z.M.A. DNA提取試劑盒（美國Omega 生物技術公司），按照說明書提取微生物基因組DNA。用微量紫外可見分光光度計（Nanodrop 2000）測定DNA樣品的濃度，根據OD260/OD280和OD260/OD230判斷核酸純度。獲得的DNA樣品放置于-20℃備用。

基因擴增和測序：以引物515F：5‘-GTGCCAG CMGCCGCGGTAA-3’和806R：5‘-GGACTACHVGGG TWTCTAAT-3’，擴增16S rRNA基因的V4區[13]，引物5’端加上獨特的barcode以區別不同的樣品。配制50 μL的PCR體系，以上述提取的DNA為模板，每個樣品各3個重復反應。PCR過程退火溫度為53℃，30個循環。將樣品的3個重復反應產物合并后，用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit（Invitrogen，美國）測定DNA濃度。然后以總量相等的方式，每21～24個樣品取樣合并成一個文庫。最后將合并后的文庫用PCR產物純化試劑盒純化，并用QuantiT PicoGreen dsDNA Assay kit、Nanodrop 2000 和瓊脂糖凝膠電泳分析純化后DNA的濃度和質量。最后送北京諾禾致源公司測序，采用的高通量測序技術為Illumina Hiseq 2500。

測序結果分析：將獲得的clean tags用Quantitative Insights Into Microbial Ecology (QIIME 1.9.0) 軟件分析[14]，以97%的相似性提取可操作分類單元（OTUs），獲得樣品中細菌和古菌從門到屬的分類信息、α多樣性指數（chao1, Shannon等）和β多樣性分析結果。

1.6 統計分析

文中數據用Excel 2013進行基礎計算，用Origin 9.0制圖，以指標濃度梯級變化量占原始濃度的百分比來計算各工藝階段對指標去除的貢獻率。微生物群落的主成分分析（PCA）用Canoco 5.0軟件來執行。

2 結果與分析

2.1 水質指標變化

在生豬廢水處理過程中，pH值波動較為平緩，流化床提升了廢水pH值，而人工濕地降低了廢水pH值，主要的水質指標包括COD、TP、NH4+-N和TN呈現出總體下降的趨勢（表1）。通過計算每個階段對主要水質指標去除的貢獻，發現TP的去除率最大，各節點的貢獻率依次為人工濕地（53.33%）＞流化床（49.94%）＞氧化池（24.82%）＞厭氧消化（15.13%）。人工濕地和流化床工藝都有較好的TP去除效果，但是兩者的作用機制完全不同，前者主要通過填料吸附和植物吸收，后者是通過添加化學試劑實現磷回收。COD的去除率次之，各節點的貢獻率依次為厭氧消化（40.28%）＞人工濕地（36.30%）＞流化床（18.99%）＞氧化池（7.75%），說明厭氧消化是生豬廢水COD降解的主要環節。人工濕地也具有較高的COD去除能力，其主要通過填料截留和微生物降解來實現。NH4+-N和TN的去除率相對要低，各節點對NH4+-N的貢獻率依次為人工濕地（67.64%）＞氧化池（10.26%）＞流化床（8.46%）＞厭氧消化（7.56%），對TN的貢獻率依次為人工濕地（54.74%）＞流化床（16.97%）＞氧化池（7.68%）＞厭氧消化（4.71%），可以看出厭氧消化對NH4+-N和TN的去除能力有限，這與生豬養殖廢水具有相對較低的碳氮比有關。相比之下，人工濕地對NH4+-N和TN的去除貢獻最大，主要是因為垂直流人工濕地具有較強的硝化能力。可能是由于氧化池的曝氣量不足，其對NH4+-N的轉化未達到較好的效果。氧化池的廢水經過流化床處理后，COD已達到畜禽養殖業水污染物排放要求（400 mg/L），TP接近排放要求（8.0 mg/L），NH4+-N遠未能達到排放要求（80 mg/L）；而經過人工濕地處理后，COD和TP皆達到排放要求，NH4+-N接近排放要求。

表1 生豬養殖廢水處理過程水質指標的變化Table 1 The change of water quality parameters during swine wastewater treatment

2.2 抗生素濃度變化

抗生素檢測數據顯示：生豬廢水中OTC濃度最高，達到34.60 μg/L，SM2和CIP濃度相對較低（表2），廢水處理過程中抗生素濃度整體呈現出下降趨勢。通過計算每個階段對抗生素去除貢獻，發現OTC和CIP具有相似的去除規律，厭氧消化池、流化床和人工濕地對兩種抗生素都具有較高的去除能力，而氧化池的作用很有限。與之不同的是，厭氧消化池、氧化池和人工濕地對SM2具有較好的去除效果，但流化床的去除貢獻很低。這可能與三種抗生素的化學吸附和生物降解特點有關。對比流化床，人工濕地對三種抗生素皆有較高的去除能力，而流化床對SM2的去除率很低。

表2 生豬養殖廢水處理過程抗生素濃度和去除率分析Table 2 Concentrations and removal efficiencies of three antibiotics during swine wastewater treatment

2.3 耐藥細菌的鑒別和數量統計

圖2展示了生豬養殖廢水處理過程耐藥細菌菌落豐度的變化。由于培養基的選擇性，數據統計結果偶爾會出現總可培養陰性細菌數量大于總可培養細菌的情況。另外，由于部分細菌存在多重耐藥，三種抗生素耐藥菌的總和有可能大于總細菌數量。但這并不妨礙分析各個水處理階段對代表性細菌去除的貢獻。

我國從個人稅收遞延型商業養老保險開始試點，探索建立我國個人養老金體系。試點區域為上海市、福建省(含廈門市)和蘇州工業園區，為期一年。我國個人養老金計劃堅持賬戶多元化金融投資的方向，待試點結束后，還將根據試點情況有序擴大參與的金融機構和產品范圍，將公募基金等產品納入個人商業養老賬戶投資范圍。

以大腸埃希氏菌和糞鏈球菌為主的紅色菌落來看，在耐藥細菌數量的比較上， OTC的耐藥細菌數高于SM2，遠高于CIP（差一個數量級）。無論是無抗條件下的細菌數還是耐藥細菌數，在各廢水處理環節中都是持續降低，其中厭氧消化池的貢獻最大，超過80%，人工濕地的去除效果優于流化床。

從奇異變形桿菌、鼠傷寒沙門氏菌和宋內氏志賀氏菌為主的無色菌落來看，在耐藥細菌數量的比較上，與紅色菌落相似，同樣是OTC的耐藥細菌數最大，其次是SM2，再次是CIP，OTC的耐藥細菌數要比CIP多一個數量級。在各處理環節的貢獻方面，與紅色菌落有所差異，厭氧消化對無抗條件下的細菌和OTC耐藥菌的去除貢獻占50%～60%以上，氧化池的去除貢獻占25%以上。此外，無色菌落在流化床中去除效果不顯著，但在人工濕地中仍具有不同程度的去除。

根據紅色菌落和無色菌落平板計數的結果，對總可培養陰性細菌進行統計?？梢钥闯?，OTC的陰性耐藥細菌與無抗條件下的陰性細菌數量很接近，說明大部分陰性細菌都具有OTC耐藥性。而CIP的陰性耐藥細菌數要比它們低1個數量級，說明僅有10%的可培養陰性菌具有CIP耐藥性。厭氧消化對OTC的陰性耐藥細菌的去除貢獻大于60%，對SM2的陰性耐藥細菌的去除貢獻大于80%，對CIP陰性耐藥細菌的去除貢獻大于90%。而氧化池對OTC的陰性耐藥菌的去除貢獻大于20%，這是另外兩種抗生素的陰性耐藥菌所不具備的。若以氧化池的數據為起始計算，人工濕地對3種抗生素陰性耐藥細菌后續去除率大于80%；而流化床僅對CIP的陰性耐藥細菌的去除率接近30%。

總可培養細菌的計數結果顯示，在無抗LB培養基上總可培養細菌的數量要大于耐藥菌；相較總可培養陰性耐藥細菌，三種抗生素之間總可培養耐藥細菌的數量差距比較小，說明CIP的總可培養耐藥細菌是以革蘭氏陽性菌為主。比較各處理階段，厭氧消化是細菌數量降低的主要環節，去除貢獻都達到90%以上。若以氧化池的數據為起始計算，人工濕地對3種抗生素耐藥細菌的后續去除率達到60%～80%；而流化床對OTC和SM2的耐藥細菌的去除率分別近30%和80%，但CIP的耐藥細菌數量反而有所升高。

2.4 微生物群落組成變化和病原菌的消減

在廢水處理過程中，由于水質參數的變化，微生物群落也在發生巨大的變化。如圖3所示，在門水平上，盡管原水、厭氧消化池和氧化池的主要微生物組成相似，但可以看出擬桿菌門（Bacteroides）的占比在逐漸上升，而厚壁菌門（Firmicutes）的占比在逐步下降。在流化床階段，變型菌門（Proteobacteria）的占比大幅上升，厚壁菌門的占比小幅上升，而擬桿菌門的占比大幅下降。與氧化池相比，人工濕地環節的擬桿菌門和厚壁菌門占比都下降，而變型菌門和古菌Parvarchaeota明顯增加。這些結果說明隨著處理層級的增加，微生物群落變化越來越大，尤其是到了流化床和人工濕地階段。

在門水平上，我們繼續對生豬廢水處理過程各環節的微生物群落進行主成分分析（PCA），探查主要微生物門類在各個環節的分布情況（圖4）。從圖上可以清楚看出，原水、厭氧消化池和氧化池樣品的微生物群落相似度較高，遺傳距離接近，相比之下，流化床和人工濕地樣品微生物群落與他們存在非常大的差異，并流化床和人工濕地之間也存在微生物群落的巨大差異。主要的微生物門類中，擬桿菌門、疣微菌門（Verrucomicrobia）和螺旋體門（Spirochaetes）主要分布在原水、厭氧消化池和氧化池樣品中；藍細菌門（Cyanobacteria）、浮霉菌門（Planctomycetes）、Parvarchaeota、黏膠球形菌門（Lentisphaerae）主要分布在人工濕地樣品中；變型菌門更多分布于流化床樣品中；此外，厚壁菌門在除了人工濕地外的樣品均有較多的分布。PCA分析結果直觀明了地顯示出廢水處理各個環節微生物群落分布的差異。

根據毒力因子數據庫網站（http://www.mgc.ac.cn/cgi-bin/VFs/jsif/main.cgi）提供的病原細菌菌屬信息，對各個環節廢水中病原菌的占比進行統計，分析生豬廢水處理過程中病原細菌的變化趨勢（圖5）。原水中占比較大的病原菌依次為梭菌屬（Clostridium）＞假單胞菌屬（Pseudomonas）＞鏈球菌屬（Streptococcus）＞不動細菌屬（Acinetobacter）。隨著廢水處理的進行，從原水到流化床，梭菌屬、鏈球菌屬和不動細菌屬都經歷逐漸的下降過程，病原細菌總量有近50%幅度的下降。從原水到人工濕地，病原細菌總量下降幅度更大，超過85%，而且病原菌各分類的占比也發生巨大的改變，梭菌屬和假單胞菌屬的占比大幅度下降，但不動細菌屬和芽孢桿菌屬（Bacillus）的占比有些上升。

3 討論

水質達標排放是生豬廢水處理工藝設計和運行的首要目標。厭氧消化能將可降解有機質分解為CH4和CO2。在本調查研究中，厭氧消化池對COD的去除貢獻最大，達到40.28%（表1）。盡管人工濕地也能較大程度降低COD，但未能實現有機質能源化的目的?？梢妳捬跸卮_實是生豬廢水資源化不可缺少的工藝環節。在TP的去除方面，盡管人工濕地對TP具有最好的去除效果，但其主要通過填料吸附[11]和植物吸收[16]，在廢水磷濃度高的情況下，容易出現吸附飽和。本研究中磷酸氨鎂流化床工藝對TP的回收去除接近50%，該技術是通過化學結晶的方法，將PO43-和部分NH4+結晶化顆?；痆17]，水體中的PO43-濃度越高越有利于結晶化，但厭氧消化和氧化池階段，已經共近40%TP被懸浮物吸附沉降，影響到流化床技術的效率最大化。經過流化床處理后TP濃度仍有些微大于達標排放濃度，這與該技術結晶臨界濃度有關，或許可通過技術改良得到解決。

本調查研究中，厭氧消化、氧化池和流化床對NH4+-N的去除貢獻都不太理想，這里氧化池的NH4+-N轉化率不高可能是因為曝氣不足，氧化池末后端兼具沉淀池功能。如果不用人工濕地，要想NH4+-N達標排放，必須增加多級氧化或者NH4+-N吹脫工藝[18-19]，但是必然會增加運行成本。從實驗結果分析來看，若在流化床后再加人工濕地能夠實現生豬廢水的達標排放。經流化床處理后TP濃度下降，可減緩人工濕地的吸附飽和，而且人工濕地運行成本低但功能卻比較全面。但經流化床后，廢水中增加MgCl2的濃度，且提升了pH值，是否影響人工濕地運行需要進一步研究。

本調查研究在原水中三種抗生素檢出濃度范圍3.42～34.60 μg/L（表2），與Wei等[20]和Chen等[21]報道的生豬廢水抗生素殘留情況相吻合。生物降解、化學吸附以及水解和光解是廢水處理工藝抗生素主要去除方式，另外在人工濕地中存在植物吸收和分解的過程[22]。在廢水處理過程中OTC和CIP表現出相似的去除規律，與SM2的去除截然不同，這與抗生素的介質吸附能力（用吸附平衡常數Kd值表示）有關。根據文獻統計，不同介質中四環素類、磺胺類和喹諾酮類抗生素的Kd值范圍分別在290～1 620 L/kg、0.9～10 L/kg[23]和260～6 310 L/kg[24]之間。四環素類和喹諾酮類抗生素具有較強的介質吸附能力。厭氧消化對OTC和CIP的去除率高于SM2，除了生物降解外，污泥吸附也是很重要的原因。同理，流化床和人工濕地工藝對OTC和CIP的去除率也遠高于SM2，流化床結晶出的磷酸銨鎂顆粒和人工濕地的填料都是潛在的吸附介質[25-26]，人工濕地可通過植物吸收和微生物降解實現抗生素的礦化，而磷酸銨鎂富集的抗生素對施肥土壤的影響還需要進一步研究[27]。相比之下，由于SM2的介質吸附弱，其主要通過生物降解以及水解光解去除，盡管整體去除率要低些，但介質吸附的后續影響很小。有研究發現，環境中低濃度的抗生素也有可能通過多種抗生素的共選擇再加基因的水平轉移方式誘導微生物產生耐藥[28]。因此，盡管目前養殖廢水排放標準尚未針對抗生素設定，盡可能降低廢水中的抗生素是廢水處理工藝的基本方向?；谌斯竦貎炐愕目股匚胶徒到饽芰?，在廢水排放之前經人工濕地處理是非常必要的。

耐藥細菌作為宿主，對耐藥基因的傳播擴散起到決定性的作用。廢水處理工藝對耐藥基因的去除能力主要體現在對耐藥細菌的消除和控制上[29]。根據檢測結果可以看出厭氧消化對耐藥細菌的去除貢獻最大（圖2），這一方面是因為厭氧消化是廢水處理的首個環節，更主要的是厭氧過程伴隨著產酸產甲烷，COD濃度大幅下降，環境改變使得部分耐藥細菌無法適應，在競爭中逐步消退。此外，不管使用哪種培養基，流化床對以奇異變形桿菌、鼠傷寒沙門氏菌和宋內氏志賀氏菌為主的無色菌落沒有明顯去除，甚至有不同程度的提升，這直接影響到總可培養陰性細菌的統計。而且流化床對無抗和CIP選擇下的總可培養細菌也表現出一定程度的提升。流化床階段外源添加MgCl2，而且水力流態和供氧水平得到提升，這樣的環境條件可能對部分耐藥細菌有選擇偏好，但其內在的機理尚不清楚。再者，經人工濕地處理后，不同耐藥細菌的數量都表現出比較一致的下降。潛流型人工濕地首先起到滲濾的功能，廢水中微生物會被人工濕地土壤和填料攔截，微生物量通常會大幅下降[30-31]，而且潛流人工濕地屬于典型的好氧系統，其與水體環境截然不同也加劇微生物類型的改變[32]。廢水處理過程微生物群落的改變對于理解這個過程耐藥細菌的變化有一定的幫助（圖3）。從原水到厭氧消化再到氧化池，微生物群落組成變化的銜接性較好。然而從氧化池到流化床或者從氧化池到人工濕地，微生物群落變化都非常劇烈，與這兩個工藝環節獨特的微環境是分不開的。最后，廢水處理各個環節病原菌數量占比統計結果也顯示出潛流人工濕地在減少廢水病原菌方面的巨大優勢（圖5），在生豬廢水處理末端設置人工濕地是大幅降低養殖廢水病原菌的可行方案。

4 結論

研究表明，厭氧消化在COD降解和耐藥細菌削減上貢獻較大，而磷酸銨鎂流化床對于磷素回收具有良好的效果。然而采用厭氧消化—氧化池—流化床工藝組合處理后的廢水，仍存在NH4+-N難以達標、抗生素殘留濃度仍偏高、部分耐藥細菌數據出現反彈等不足之處。研究發現潛流人工濕地水質處理能力比較全面，尤其是NH4+-N去除效果良好，同時能夠進一步去除抗生素和耐藥細菌，在降低病原細菌豐度方面優勢也非常顯著。因此，研究建議設置潛流人工濕地承接流化床出水可進一步深度處理生豬廢水。