天祝白牦牛與黃牛NGB蛋白三級結構比較分析

米曉鈺，李 喬，馬 睿，朱曉林，溫永強，劉 霞*，杜曉華

(1.甘肅農業大學 生命科學技術學院， 蘭州 730070；2. 甘肅農業大學 動物醫學院，蘭州 730070)

腦紅蛋白(Neuroglobin，NGB)是德國科學家Burmester于2000年首次發現的一種特異性攜氧球蛋白，主要分布于中樞神經系統[1]。與血紅蛋白、肌紅蛋白相比，NGB具有經典螺旋三折疊結構的特點，其基本結構是蛋白質肽鏈和 1 個血紅蛋白[2]。蛋白質結構是生物長期演化出的結果，從 DNA 編碼轉錄翻譯到蛋白質序列折疊形成穩定的空間結構，并非一個隨機產生的過程。對任意蛋白質的序列進行修改，即使只增加、刪除或修改蛋白質序列中的一個氨基酸，蛋白質結構都會發生明顯的改變，相應的蛋白質功能也會隨之變化，而如果修改兩個及以上氨基酸，多數蛋白將無法進行有效的折疊[3]。要想深入探究蛋白質的內部功能機制，則首先需要證明蛋白質結構與其功能之間的關系。近年來，國內外學者主要對NGB轉錄調控機制及其在神經元中的保護作用開展了相關研究工作[4-7]，至于NGB蛋白結構學方面的研究，則多集中于對其基本結構[8]及功能相關核心位點的研究[9-10]，國內目前對于該項工作的研究尚處于生物信息學的初步分析階段[11]，而針對NGB蛋白三級結構的詳細預測分析還未見相關報道。本項目組李盛杰等[12]研究發現，天祝白牦牛NGB基因編碼的氨基酸序列與普通黃牛相比，在第83、97位分別發生了絲氨酸(Ser)→脯氨酸(Pro)、精氨酸(Arg)→谷氨酰胺(Gln)的突變，但其生物學意義目前尚不明確。針對天祝白牦牛NGB蛋白兩處氨基酸位點突變，本文擬從蛋白質三級結構模型分析突變造成的NGB蛋白結構變化，并與黃牛NGB蛋白的三級結構進行比較，推測天祝白牦牛NGB蛋白位點突變對其三級結構的影響，為進一步探究高原低氧環境下牦牛NGB蛋白的遺傳特性和生理機制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 NGB蛋白同源性比較分析

登陸Genbank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)下載天祝白牦牛、黃牛、甘南牦牛、綿羊、獼猴、人類、紅原雞等25個物種的NGB氨基酸序列(登錄信息見表1所示)。利用Clustal-Raindy、MEGA等軟件對25個物種NGB蛋白氨基酸序列進行同源性比較，并建立系統進化樹。

1.2 NGB蛋白三級結構比較分析

利用Swiss Model(https://swissmodel.expasy.org/interactive)在線軟件對天祝白牦牛、黃牛NGB蛋白進行三維建模，并用Spdbv軟件進行蛋白質模型輸出。

2 結果分析

2.1 天祝白牦牛NGB蛋白同源性

研究結果顯示(見圖1)，天祝白牦牛NGB蛋白151個氨基酸殘基中，65個氨基酸殘基為保守序列，26個氨基酸殘基為保守替換，9個氨基酸殘基為半保守替換，51個氨基酸殘基為未知突變。其中，與NGB蛋白功能相關核心His 64、His 96在進化中為保守序列，Cys 46為未知突變，Cys 55為保守序列；天祝白牦牛兩處突變氨基酸， 83號位點在進化中為未知突變；97號位點為保守替換。

2.2 天祝白牦牛NGB蛋白系統發育進化

不同物種NGB蛋白的聚類關系主要分為四大簇，分別為哺乳綱簇、兩棲綱簇、鳥綱簇和魚綱簇，且進化趨于保守(見圖 2)。哺乳綱簇中，天祝白牦牛NGB與甘南牦牛、黃牛、印度水牛、綿羊等牛科動物的親緣關系最近，分支支持率為100%；與白犀牛、穴兔、貂熊、黑猩猩、人類、小鼠等物種的親緣關系次之，分支支持率大于50%；與鼠狐猴、雙峰駝等的親緣關系較遠，分支支持率小于50%。兩棲綱簇以熱帶爪蟾單獨聚為一分支，鳥綱簇以紅原雞單獨聚為一分支，魚綱簇以虹鱒魚、斑馬魚、河豚單獨聚為一分支，均與天祝白牦牛NGB親緣關系較遠。

表1 不同物種NGB蛋白序列信息Table 1 Sequence information of NGB protein in different species

2.3 天祝白牦牛NGB蛋白三級結構

2.3.1 NGB蛋白基本結構

分別利用天祝白牦牛與黃牛NGB蛋白在Swiss Model中的不同輸出模板，用Spdbv軟件對兩物種NGB蛋白進行同源建模，得到天祝白牦牛與黃牛NGB蛋白基本結構，如圖3所示。天祝白牦牛與普通黃牛NGB蛋白為血紅素蛋白，金屬蛋白亞類，卟啉環中心含一個鐵原子，該原子在軸兩極等距的中緯線上與卟啉環上的四個氮原子以及近端His 96協調配位；在還原狀態下，His 64上的一個氮原子與中心鐵原子配位，形成雙組氨酸六配位結構(見圖3A、3B)。其中，天祝白牦牛近端His 96與中心鐵原子距離為2.00 ?，遠端His 64 與中心鐵原子距離為2.10 ?；黃牛近端His 96與中心鐵原子距離為1.98 ?，遠端His 64與中心鐵原子距離為2.17 ?。天祝白牦牛與普通黃牛NGB蛋白三級結構主要是由8個α-螺旋構成的蛋白質多肽，α-螺旋之間的拐彎由1～8個殘基構成無規卷曲，其中A，B，E，F，G，H α-螺旋被組裝成兩層結構，肽鏈盤繞成球形把血紅素分子緊密包裹其中；分子內部幾乎全部為疏水性R側鏈，分子外表面則包括疏水性和親水性氨基酸殘基，絕大多數親水性R側鏈在分子外表面，使NGB蛋白為可溶于水的蛋白質(見圖3C、3D、3E、3F)。

2.3.2 NGB蛋白與功能相關核心結構

NGB蛋白與功能相關核心結構有：血紅素“漏斗”結構，腔/隧道結構以及CD環結構。

血紅素“漏斗”結構：如圖4A-F所示，NGB蛋白Phe 28，Phe 42、Tyr 44、Lys 67、Val 68構成疏水腔體[13-15]，形似“漏斗”，落在血紅素縫隙外，通過與血紅素丙酸鹽的靜電作用，參與維持血紅素穩定，天祝白牦牛與黃牛NGB蛋白Tyr 44空間取向存在差異(見圖4A、4B、4D、4E)，黃牛Tyr 44氧原子指向卟啉環中心。

圖3 天祝白牦牛與黃牛NGB蛋白基本結構Fig.3 Basic NGB protein structure of Tianzhu white yak and cattle

腔/隧道結構：如圖4G-L所示，NGB腔/隧道結構包括Val 71，Ile 72，Val 109，Leu 113，Leu 136和Val 140[8]，該結構在天祝白牦牛和黃牛基本一致。

CD環結構：天祝白牦牛Cys 46-Cys 55形成二硫鍵(見圖4M)，而黃牛Cys 46、Cys 55未形成二硫鍵，鍵距為18.79 ?(見圖4N)。

圖4 天祝白牦牛與黃牛NGB蛋白與功能相關核心結構Fig.4 Function-related core structure of NGB protein in Tianzhu white yak and cattle

2.4 天祝白牦牛NGB蛋白突變相關結構

對編碼NGB蛋白突變位點氨基酸的密碼子進行分析，天祝白牦牛NGB蛋白83號位點原Ser密碼子分別為UCU、UCC、UCA、UCG，經突變后Pro密碼子分別為CCU、CCC、CCA、CCG，主要為1號位U突變為C；97號位點原Arg密碼子分別為CGA、CGG，經突變后Gln密碼子分別為CAA、CAG，主要為2號位G突變為A。

對NGB蛋白突變位點氨基酸殘基的分布特征進行分析，結果列于表2，3及圖5。由表2可知，天祝白牦牛和黃牛NGB蛋白突變位點的氨基酸殘基中Ser，Pro，Arg，Gln構成α-螺旋和無規卷曲占比不同，在天祝白牦牛中構成α-螺旋分別占：4.6%，2.7%，3.9%，2.7%；在黃牛中分別占：5.3%，2.7%，4.6%，1.9%；在天祝白牦牛中構成無規卷曲分別占：4.6%，3.9%，1.9%，1.3%；在黃牛中分別占：4.6%，3.3%，1.9%，1.3%。

表2 天祝白牦牛與黃牛NGB蛋白突變位點氨基酸殘基組成Table 2 Composition of amino acid residues at the mutation sites of NGB protein in Tianzhu white yak and cattle

表3 天祝白牦牛與黃牛NGB蛋白Ser、Pro、Arg及Gln分布位點比較Table 3 Comparison of Ser, Pro, Arg, and Gln sites of NGB protein between Tianzhu white yak and cattle

由表3和圖5結果可知，天祝白牦牛NGB蛋白Ser多位于α-螺旋的端位，且突變前有4個位點相鄰(50、51，57、58，83、84，104、105)，醇羥基氧原子指向親水相(圖5B、5F)；NGB蛋白Pro多位于無規卷曲，在第20，52，59，83位點與Ser 19，51，58，84位點相鄰，四碳環指向疏水相(圖5D、5H)；Arg、Gln多位于α-螺旋的中間位，R側鏈氨基端指向親水相，羧基端參與構成α-螺旋；Arg第10、47位與Gln第11、48位相鄰(圖5J、5N、5L、5P)。

重合天祝白牦牛與黃牛NGB蛋白三級結構，發現重合度較高，但CD環形態(見圖6A，黃色圓圈圈出結構)存在一定差異；天祝白牦牛83號位點為無規卷曲，黃牛83號位點為α-螺旋(見圖6B、6C)，97號位點二者均為α-螺旋(見圖6B、6D)。其中，NGB蛋白Ser突變為Pro主要為R側鏈由醇羥基突變為四碳環，側鏈結構發生改變(見圖6E、6G)；突變位于E、F鏈之間，對使得E、F鏈之間的間距由11.79?變為8.21?(見圖6F、6H)；Arg突變為Gln主要為R側鏈由氮原子突變為氧原子，且與碳原子通過雙鍵連接，側鏈結構未發生改變 (見圖6I、6K)；97號位點突變基團指向親水相，羧基端與96號位點相連，對96號位點取向造成影響(見圖6J、6L)。

圖5 天祝白牦牛與黃牛NGB蛋白Ser、Pro、Arg及Gln分布特征比較Fig.5 Comparison of distribution characteristics of Ser, Pro, Arg and Gln of NGB protein in Tianzhu white yak and cattle

圖6 天祝白牦牛與黃牛NGB蛋白突變位點結構比較Fig.6 Comparison of mutation site structures of NGB protein in Tianzhu white yak and cattle

3 討論與結論

對NGB蛋白的同源序列比較發現，在哺乳動物NGB蛋白中，天祝白牦牛是唯一出現83號位點突變的物種，分析其可能的原因是機體在長期適應高寒低氧環境過程中產生了DNA自發性損傷，編碼氨基酸的密碼子發生突變，進而導致氨基酸種類由Ser突變為了Pro。比較天祝白牦牛和黃牛NGB蛋白Ser和Pro三級結構的分布特征發現，天祝白牦牛NGB蛋白83號位點Pro偏向于形成無規卷曲(3.9%)，而無規卷曲對蛋白質的穩定性和柔韌性均會產生影響[16]，因此該突變很可能會對天祝白牦牛NGB蛋白質結構的穩定性和柔韌性帶來一定程度的改變。此外，有研究發現Ser具有不帶電荷的極性側鏈(β羥基)，有親水性，并易被酯化和糖基化；Pro為疏水氨基酸，且與其它標準氨基酸在結構上有很大不同(α亞氨基酸)，具有環化的側鏈，該側鏈對蛋白質的立體結構有很大制約[17]，因此，Ser突變形成Pro，對NGB蛋白質溶解度可能會產生一定影響。不過，上述83號突變位點對NGB蛋白產生的一系列影響是否會進一步帶來功能上的變化仍需更深入的研究探討。

本研究結果顯示，在還原狀態下，天祝白牦牛 NGB 蛋白可形成雙組氨酸六配位結構，Liu等[18]及 Hota等[19]研究認為在正常生理條件下， NGB 約占細胞總濃度的 30%，在低氧條件下，許多神經保護性低氧誘導型基因(如低氧誘導因子-1α，血管內皮生長因子，血紅素加氧酶-1和促紅細胞生成素)上調以協助促進細胞存活，這使得 NGB 濃度迅速上升到原濃度的 80%，且這種上升發生在數秒之間，說明NGB蛋白在還原狀態下大量穩定存在有利于機體適應高原低氧環境，而83號位點突變造成了E、F鏈距離變窄，致使核心His 64與卟啉環中心距離變短(由2.17?變為2.10?)，使還原狀態下天祝白牦牛NGB蛋白結構更為穩定，這可能是NGB蛋白在牦牛適應高原低氧環境中發揮作用的重要結構基礎。有研究報道顯示，NGB蛋白與外源性配體如O2、CO、NO 等發生結合時，首先要打破鐵和遠端His 64之間的紐帶，而后外源性配體才有可能與NGB結合，外源性配體與內源性遠端His 64之間的競爭導致了配體結合動力學的復雜模式[20]，因此His 64位點與卟啉環中心距離的改變極有可能對血紅素外源配體的結合產生一定的影響。由此，83號位點突變很有可能是天祝白牦牛適應高寒低氧環境所必須的，后續實驗可繼續針對天祝白牦牛該突變位點與NGB蛋白配體結合能力之間的聯系開展相應研究工作。

與83號位點相比較，天祝白牦牛NGB蛋白97號位點的突變是保守替換，雖然導致了氨基酸種類發生改變，但對NGB蛋白結構并未產生影響，不過研究顯示Arg等電點為10.76，而Gln等電點為5.65[17]，差異較大，提示該位點突變也會對NGB蛋白的溶解度產生一定影響。此外，97號位點突變使核心His 96與卟啉環中心距離由1.98 ?變為2.00 ?，說明該突變對96號位點的向心取向會造成一定改變，由于His 96是整個NGB蛋白最核心的位點，決定著NGB蛋白的活性[21]，因此向心取向的變化可能會對NGB蛋白功能的發揮造成影響，究其具體影響范圍和機制尚有待進一步試驗驗證。總體而言，97號位點突變雖然對蛋白質基本結構不造成影響，卻改變了蛋白核心位點的向心取向，同時對蛋白質溶解度也造成了一定影響，此外，與天祝白牦牛親緣關系最近的甘南牦牛也存在97號位點的突變現象，對該位點突變的深入探究同樣具有十分重要的意義。

相較于黃牛，天祝白牦牛NGB蛋白兩處氨基酸突變對其血紅素“漏斗”結構及腔/隧道結構均未造成影響，說明兩結構在進化中趨于保守，但CD 環結構存在一定差異。研究表明，NGB 蛋白 CD 環上的 Cys 46、Cys 55 因其 R 基團具有-SH，因此可在空間形成二硫鍵，Cys 46-Cys 55 鍵的形成可降低血紅素-Fe 原子的第六配位鍵的強度，促進配體結合；相反，Cys 46-Cys 55 鍵的裂解可穩定血紅素-Fe 原子的六配位鍵并損害金屬中心的反應性[22-25]，天祝白牦牛 Cys 46-Cys 55 鍵為結合狀 態，而黃牛為斷裂狀態(鍵距：18.79?)，說明天祝白牦牛 NGB 蛋白配體結合能力更強，鑒于目前有大量NGB蛋白結構學研究集中在對其CD 環結構的研究上[9,10,23,24]，也進一步印證了其重要性，天祝白牦牛相較于黃牛CD 環結構的差異是否與兩處突變位點有關聯仍有待更進一步的分析驗證。