檢測豬瘟病毒E0抗體ELISA方法的建立與應(yīng)用

吳許丹，吳月，陳艷，張錦，陳婧，胡家歡，龍云鳳，姜焱*，周斌*

(1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095;2. 南京海關(guān)動植物與食品檢測中心，江蘇 南京 210019)

豬瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)是黃病毒科(Flaviviridae)瘟病毒屬(Pestivirus)的一種正鏈RNA病毒[1]。豬瘟一旦暴發(fā)，疫源地的養(yǎng)殖業(yè)及政府都苦不堪言，全球每年因豬瘟遭受的經(jīng)濟(jì)損失數(shù)以億計[2]。CSFV基因組是由兩端的非編碼區(qū)和位于中央的開放式閱讀框(open reading frame，ORF)組成[3]。該閱讀框編碼的多聚蛋白在蛋白酶的作用下被分解成4個結(jié)構(gòu)蛋白(C、E0、E1和E2)和8個非結(jié)構(gòu)蛋白(Npro、P7、NS2、NS3、NS4B、NS4A、NS5A和NS5B)[4]。E0蛋白又稱為Erns蛋白，是CSFV的一種囊膜糖蛋白，由多聚蛋白上268位的Glu至494位的Ala之間的227個氨基酸構(gòu)成，分子量大小為44～48 kDa[5-6]。E0蛋白存在大量的抗原表位，能在病毒感染機(jī)體后誘導(dǎo)產(chǎn)生特異的免疫應(yīng)答反應(yīng)。可利用E0蛋白的初級抗原表位進(jìn)行鑒別診斷，特異性區(qū)分CSFV、牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)和邊界病病毒(border disease virus，BDV)感染[7]。我國《國家中長期動物疫病防治規(guī)劃(2012—2020)》中已經(jīng)明確將豬瘟的凈化列為重點任務(wù)。鑒于目前的豬瘟病毒兔化弱毒疫苗免疫豬群后不能開展血清學(xué)鑒別診斷，不少豬場已經(jīng)開始采用新疆天康生物股份有限公司[8]或者武漢科前生物股份有限公司[9]生產(chǎn)的豬瘟病毒E2亞單位疫苗，免疫后可以引導(dǎo)豬群產(chǎn)生針對E2蛋白的抗體。但應(yīng)用檢測E2抗體的試劑盒無法區(qū)分豬群中是否存在野毒感染，因此可通過檢測E0蛋白的抗體確定豬群中是否存在野毒感染。本研究根據(jù)石門株E0基因序列，設(shè)計1對特異性引物，通過RT-PCR擴(kuò)增目的基因，插入原核表達(dá)載體pET-28a中，構(gòu)建了pET-28a-E0原核表達(dá)質(zhì)粒。誘導(dǎo)表達(dá)后獲得的目的蛋白經(jīng)鑒定后進(jìn)行梯度稀釋，包被ELISA抗原板，通過多次優(yōu)化，建立了檢測CSFV E0抗體的ELISA方法，并檢測了臨床豬血清樣本，驗證了此方法的臨床應(yīng)用效果，用于初步檢測或者鑒別診斷。

1 材料與方法

1.1 毒株、載體和血清樣本

大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)購自北京莊盟生物科技有限公司；pET-28a原核表達(dá)載體由本實驗室保存；原核表達(dá)的E2蛋白由本實驗室保存；豬瘟病毒石門株、豬瘟標(biāo)準(zhǔn)陽性和陰性血清購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；豬臨床血清樣本來自南京晟泰沅農(nóng)牧發(fā)展有限公司和新疆天康生物技術(shù)股份有限公司。豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬偽狂犬病毒(PRV)和豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)陽性血清由本實驗室保存。

1.2 主要試劑

RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA Marker、限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ、XhoⅠ、Primer Star及T4 Ligase購自大連寶生物科技有限公司(TaKaRa)；質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)mega公司；預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)購自Thermo Scientific公司；6×His標(biāo)簽高親和力Ni純化柱購自General Electric公司；BCA蛋白定量試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司；ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒購自Bio-Rad生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司；IDEXX豬瘟抗體ELISA檢測試劑盒購自美國IDEXX公司；MEDIAN/JBT豬瘟抗體ELISA檢測試劑盒購自北京金諾百泰生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.3 目的蛋白表達(dá)、純化與鑒定

1.3.1 目的基因獲取與表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建

根據(jù)GenBank登錄的石門株(AF092448)E0全長基因序列，用DNA STAR軟件設(shè)計1對E0全長基因特異性引物(F：5′-TGACGGATCCATGGAAAA-TATAACTCAATGGAACCTGAGCG-3′,R：5′-TGACCTCGAGGGCATAGGCACCAAACCAG-3′)，并引入BamHⅠ和XhoⅠ兩個酶切位點，交由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。提取病毒RNA后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并經(jīng)上述引物擴(kuò)增獲取目的基因。瓊脂糖凝膠電泳鑒定后回收目的片段，雙酶切處理目的基因和pET-28a原核表達(dá)載體，純化后經(jīng)T4 Ligase酶16 ℃過夜連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 DH5α細(xì)胞，挑選單克隆子擴(kuò)大培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切和測序鑒定，序列正確的原核表達(dá)質(zhì)粒命名為pET-28a-E0。

1.3.2 目的蛋白表達(dá)、純化與鑒定

將成功構(gòu)建的質(zhì)粒pET-28a-E0克隆至大腸桿菌BL21細(xì)胞，挑選單克隆37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)至OD600值約為0.6時終止培養(yǎng)，4 ℃冰箱放置15 min。 再加入終濃度0.1 mmol/L的IPTG，37 ℃搖床誘導(dǎo)5 h。離心分離上清和沉淀，超聲破碎后，進(jìn)行SDS-PAGE分析；分別以His標(biāo)簽抗體及標(biāo)準(zhǔn)豬瘟陽性血清作為一抗進(jìn)行Western blot鑒定。目的蛋白經(jīng)過大量表達(dá)并超聲破碎后，利用His標(biāo)簽鎳柱純化后用BCA蛋白定量試劑盒測定濃度，備用。

1.4 E0抗體ELISA方法的建立

1.4.1 最佳抗原包被濃度和一抗血清稀釋倍數(shù)

在96孔板上用方陣滴定法確定最佳抗原包被濃度和待測樣本最佳稀釋倍數(shù)，利用CBS溶液對已成功制備并測定濃度的E0蛋白進(jìn)行倍比稀釋(0.5、1、2和4 μg/mL)包被后4 ℃靜置過夜。次日用1×PBST洗滌4遍，每孔加入300 μL 1%的牛血清白蛋白(BSA)，37 ℃靜置封閉2 h。洗滌拍干，采用倍比稀釋的方法摸索最佳一抗孵育條件，第一行每孔加入100 μL PBST作為陰性對照，第2～7行加入100 μL 稀釋倍數(shù)分別為400、200、100、50、20、10和2倍的標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，37 ℃孵育1 h。棄去板內(nèi)液體，PBST洗滌4遍，拍干。每孔加入100 μL羊抗豬IgG-HRP二抗，37 ℃孵育30 min。棄去板內(nèi)液體，PBST洗滌4遍，拍干。加入TMB顯色液，每孔100 μL 避光室溫顯色5～10 min，每孔加入50 μL終止液終止顯色，使用酶標(biāo)儀讀取OD值。按照常規(guī)方陣滴定法進(jìn)行結(jié)果分析，以陽性、陰性孔OD值的比值即P/N值作為判定標(biāo)準(zhǔn)，對最佳抗原包被濃度和樣本最佳稀釋倍數(shù)進(jìn)行比較試驗，確定最佳反應(yīng)條件。

1.4.2 最佳一抗血清孵育時間

按照已確定的最佳抗原包被濃度包被ELISA板，分別用標(biāo)準(zhǔn)陽性血清樣本和陰性樣本，以最佳稀釋倍數(shù)進(jìn)行稀釋后每孔加入100 μL，設(shè)定20、30、45和60 min 4個時間段，每組3個重復(fù)。對4個不同一抗孵育時間的P/N結(jié)果進(jìn)行分析，確定最佳一抗孵育時間。

1.4.3 二抗最佳稀釋倍數(shù)

選擇標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和陰性血清，按照已確定的孵育時間和稀釋倍數(shù)進(jìn)行試驗，將羊抗豬IgG-HRP二抗分別進(jìn)行10 000、20 000、30 000、40 000和50 000倍稀釋，每組3個重復(fù)。根據(jù)每個稀釋倍數(shù)下3組重復(fù)的陰陽性平均OD值計算P/N值，確定二抗最佳稀釋倍數(shù)。

1.4.4 陰陽性判定臨界值

挑選出30個陰性樣本，按照優(yōu)化后的包被和反應(yīng)條件進(jìn)行ELISA檢測。計算30份樣本OD值的平均值(X)和標(biāo)準(zhǔn)方差(SD)。然后計算出X+2SD和X+3SD的值，確定陰陽性判定標(biāo)準(zhǔn)及可疑區(qū)間。

1.4.5 重復(fù)性試驗

1.4.6 特異性試驗

分別選取PRRSV、PRV、PCV2陽性血清和CSFV的陽性及陰性血清作為一抗血清，每個樣本做3個重復(fù)，按照優(yōu)化的包被和反應(yīng)條件進(jìn)行ELISA試驗。計算每個樣本3個重復(fù)孔的平均OD值，判定本研究方法的特異性是否良好。

1.4.7 符合率測定

用本研究建立的檢測方法檢測206份臨床血清樣本，得到的結(jié)果同商品化的CSFV抗體ELISA檢測試劑盒(IDEXX)檢測結(jié)果進(jìn)行對比，比較二者陽性符合率、陰性符合率和總體符合率。

1.5 檢測豬瘟病毒E0抗體ELISA方法的鑒別應(yīng)用

用建立的ELISA方法和商品化的CSFV E2抗體ELISA試劑盒(MEDIAN/JBT)對江蘇南京和新疆烏魯木齊地區(qū)免疫E2亞單位疫苗的85份臨床豬血清樣本進(jìn)行檢測，對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的PCR擴(kuò)增及質(zhì)粒的鑒定

以反轉(zhuǎn)錄獲得的CSFV石門株cDNA為模板，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，從圖1A中可見1條約為681 bp的明亮條帶，與預(yù)期結(jié)果一致。該片段插入原核表達(dá)載體后，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果顯示出1條約為681 bp的目的條帶和1條約為5 370 bp的載體條帶，目的條帶與PCR結(jié)果大小一致(圖1B)。將酶切鑒定成功的質(zhì)粒送至南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行測序，結(jié)果顯示目的片段序列正確。

M.DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. E0基因；2. pET-28a-E0雙酶切鑒定

2.2 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與鑒定

重組菌株BL21(pET-28a-E0) 擴(kuò)大培養(yǎng)超聲破碎后，分別收取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE鑒定。結(jié)果如圖2所示，pET-28a-E0蛋白在誘導(dǎo)后的上清和沉淀中都能表達(dá)，但包涵體表達(dá)的含量更高，條帶大小約為28 kDa，與預(yù)期相符。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1、3.誘導(dǎo)后的上清；2、4.未誘導(dǎo)的上清；5、7.誘導(dǎo)后的包涵體；6、8.未誘導(dǎo)宿主菌裂解物沉淀

IPTG誘導(dǎo)的重組菌沉淀經(jīng)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，分別以His標(biāo)簽抗體和標(biāo)準(zhǔn)豬瘟E0陽性血清作為一抗，進(jìn)行Western blot鑒定。結(jié)果表明，重組蛋白能特異性地被His標(biāo)簽抗體和豬瘟標(biāo)準(zhǔn)E0陽性血清識別，如圖3所示，28 kDa大小處均出現(xiàn)明亮條帶，最終證明重組蛋白E0成功表達(dá)且具有良好的免疫反應(yīng)性。

A.重組蛋白與His抗體反應(yīng)，其中： M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.重組E0蛋白；2.CSFV E2蛋白陽性對照；3.空載體蛋白對照；B.重組蛋白與標(biāo)準(zhǔn)E0陽性血清反應(yīng)，其中： M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.重組E0蛋白；2.空載體蛋白對照

2.3 目的蛋白純化

將鑒定成功表達(dá)的菌株大量誘導(dǎo)后進(jìn)行超聲破碎，分離上清和沉淀，通過His標(biāo)簽蛋白純化柱純化重組蛋白，用不同濃度咪唑(含有尿素)洗脫純化柱上結(jié)合的蛋白，收集各濃度洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE鑒定。根據(jù)圖4的SDS-PAGE結(jié)果顯示，在28 kDa處有明顯條帶，與未純化前重組蛋白條帶大小一致。

2.4 最佳抗原包被濃度和一抗血清稀釋倍數(shù)

從表1的結(jié)果中可以看到，當(dāng)?shù)鞍装粷舛葹? μg/mL，一抗稀釋倍數(shù)為100倍時，P/N值為29.045，顯著高于其他濃度試驗組。由此，確定最佳包被濃度為2 μg/mL，一抗最佳稀釋倍數(shù)為100倍。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～8. 咪唑洗滌緩沖液濃度分別為0、20、40、70、100、120、150和200 mmol/L

表1 重組蛋白方陣滴定結(jié)果(OD值)

2.5 最佳一抗血清孵育時間

根據(jù)表2結(jié)果顯示一抗孵育時間為45 min和30 min時的P/N值較高。由于30 min時的P/N值略高于45 min時的P/N值，而且更節(jié)省試驗時間，提高試驗效率，因此確定最佳一抗孵育時間為30 min。

表2 不同一抗孵育時間結(jié)果(OD值)

2.6 二抗最佳稀釋倍數(shù)

用標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和陰性血清按照已確定最佳蛋白包被濃度、一抗稀釋倍數(shù)和一抗反應(yīng)時間進(jìn)行試驗，將羊抗豬IgG-HRP二抗分別進(jìn)行倍比稀釋后，做3個重復(fù)。從表3結(jié)果可以看出，二抗進(jìn)行40 000倍稀釋時，陰陽性樣本平均OD值的P/N值較大，因此確定二抗最佳稀釋倍數(shù)為1∶40 000。

2.7 臨界值的確定

用本研究建立的ELISA檢測方法對所篩選的30份陰性血清進(jìn)行檢測，該30份血清樣本OD值平均值(X)為0.043，標(biāo)準(zhǔn)方差(SD)為0.125，因此X+2SD=0.293，X+3SD=0.418。當(dāng)抗體效價<0.293時，樣本判定為陰性；若0.293≤抗體效價≤0.418時，判定結(jié)果為可疑；當(dāng)抗體效價>0.418時，判定結(jié)果為陽性。

表3 不同二抗稀釋倍數(shù)結(jié)果(OD值)

2.8 重復(fù)性檢驗

重復(fù)性試驗結(jié)果從表4和表5可以看出，組內(nèi)試驗和組間試驗結(jié)果變異系數(shù)均小于10%。符合精密度標(biāo)準(zhǔn)的要求，說明建立的CSFV E0抗體ELISA方法具有良好的重復(fù)性。

表4 組內(nèi)重復(fù)性試驗結(jié)果

表5 組間重復(fù)性試驗結(jié)果

2.9 特異性試驗

根據(jù)表6結(jié)果顯示，PRRSV、PRV(gE)、PCV2陽性血清和CSFV的陰性血清當(dāng)作一抗孵育后的結(jié)果均為陰性，而用CSFV的陽性血清孵育結(jié)果為陽性，證明本研究建立的方法具有良好的特異性。

表6 重組蛋白特異性試驗結(jié)果

2.10 符合率測定

用本研究建立的ELISA方法檢測采集的206份臨床豬血清，得到的結(jié)果同商品化ELISA試劑盒進(jìn)行比較，結(jié)果見表7。由表7可見，商品化試劑盒的診斷結(jié)果為168份陽性樣本，38份陰性樣本；建立的ELISA方法檢測結(jié)果為174份陽性，32份陰性。2種方法的陽性符合率為96.55%，陰性符合率為84.21%，總體符合率為94.17%。說明本研究建立的E0抗體ELISA檢測方法同商品化試劑盒具有較高的符合率，在臨床應(yīng)用方面具有廣闊的前景。

表7 CSFV E0抗體ELISA檢測方法與商品化試劑盒診斷結(jié)果的比較

2.11 臨床樣本鑒別診斷

用本研究建立的方法及商品化CSFV E2抗體ELISA試劑盒對免疫了E2亞單位疫苗的85份血清樣本進(jìn)行檢測，結(jié)果：商品化E2抗體試劑盒檢測陽性樣本為78份，陽性率為91.76%；本研究建立的方法檢測陽性樣本為9份，陽性率為10.59%，表明本研究建立的ELISA方法具有鑒別診斷的優(yōu)點。

3 討論

E0蛋白是CSFV的一個囊膜糖蛋白，由于其功能性作用廣泛，一直是世界范圍內(nèi)研究的熱點[10]。E0蛋白能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性中和抗體，是建立CSFV血清學(xué)檢測方法的優(yōu)質(zhì)選擇[11]。在各毒株內(nèi)，E0蛋白的氨基酸序列比編碼E2蛋白的氨基酸序列要更保守，因此E0蛋白可作為防治豬瘟的一個靶蛋白[12]。另外，E0蛋白作為CSFV的主要免疫性抗原，確保了本研究所建立方法的準(zhǔn)確性。不僅如此，基于E0和E2蛋白建立的豬瘟鑒別診斷方法也得到推廣和應(yīng)用，可以更好地區(qū)分CSFV疫苗毒和野毒感染，以及制定針對性的豬瘟防控措施以及免疫程序[13]。

本研究選擇了pET-28a載體進(jìn)行E0蛋白的原核表達(dá)，pET-28a載體是一種熱表達(dá)載體，其誘導(dǎo)條件通常為37 ℃。因此，本研究通過在37 ℃誘導(dǎo)經(jīng)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后的重組菌株，使得重組目的蛋白能夠高效表達(dá)，并選擇His標(biāo)簽抗體和豬瘟病毒標(biāo)準(zhǔn)陽性血清對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Western blot鑒定。成功表達(dá)重組蛋白后，借助His標(biāo)簽蛋白純化柱純化重組蛋白，對純化后的目的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果顯示純化后的蛋白組分更純，濃度更高，具備試驗應(yīng)用價值。本研究利用純化后的CSFV E0蛋白建立了一種方便有效的間接ELISA方法，并對抗原包被濃度、一抗和二抗的稀釋倍數(shù)與孵育時間進(jìn)行了優(yōu)化。對優(yōu)化反應(yīng)條件后的ELISA方法進(jìn)行分析鑒定，重復(fù)性試驗結(jié)果顯示組間和組內(nèi)試驗的變異系數(shù)均小于10%，特異性試驗結(jié)果顯示本研究建立的ELISA方法只能與CSFV陽性血清反應(yīng)，而與其他病毒的陽性血清不反應(yīng)。因此，本研究建立的ELISA方法具有良好的重復(fù)性和特異性。與商品化試劑盒的比較，本方法具備良好的符合率。在臨床血清檢測方面，本方法也顯示出了良好的實際應(yīng)用價值。

本研究建立的CSFV E0抗體ELISA檢測方法具有臨床應(yīng)用價值，對臨床血清樣本可以進(jìn)行快速準(zhǔn)確的診斷。同時，針對免疫了豬瘟E2亞單位疫苗的豬瘟豬場，用本研究建立的方法檢出9份E0陽性樣本，說明此豬場存在亞單位疫苗免疫豬感染野毒的情況。因此，本研究建立的ELISA方法能夠及時檢測出E0抗體(野毒抗體)并完善豬場的免疫程序，初步篩查豬場是否存在野毒感染。