解淀粉芽孢桿菌ck-05發酵液的抑菌活性

劉小玉　付登強　劉立云　齊蘭

摘要：對解淀粉芽孢桿菌ck-05菌株發酵液中生物活性物質的抑菌作用及穩定性進行初步研究。采用菌絲生長速率法測定菌株ck-05發酵液對11種病原菌的抑菌作用。結果表明，ck-05菌株發酵液對供試植物病原菌均具有較強的抑菌作用，其中對香蕉枯萎病的抑制性最強，抑菌率達82.22%。另外，以香蕉枯萎病為指示菌，測定不同條件下ck-05菌株發酵液的抑菌穩定性。結果表明，發酵液熱穩定性較好;對酸堿性條件比較敏感，pH值為6～8時具有較強的抑菌作用;紫外線和自然光照射下穩定性較好，對蛋白酶不敏感。

關鍵詞：解淀粉芽孢桿菌ck-05;抑菌活性;穩定性;生長速率法;香蕉枯萎病;發酵液

中圖分類號：S182文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2021）04-0078-04

作者簡介：劉小玉（1986—），女，江西九江人，碩士，助理研究員，主要從事土壤微生物方面的研究。E-mail：liuxiaoyu06120210@163.com。

近年來，化肥的施用為作物產量的提高做出了突出貢獻，但盲目過量施用化肥，造成部分地區植物土傳病害日益加重[1]。利用化學藥劑防治植物病害會引起諸多副作用，生物防治逐漸成為農業生產中一種新的發展趨勢。解淀粉芽孢桿菌具有廣泛抗菌能力，屬革蘭氏陽性芽孢桿菌。有研究表明，解淀粉芽孢桿菌通過產生吲哚-3-乙酸（IAA），分泌葡聚糖酶、幾丁質酶以及抗菌活性物質，達到防治植物病害的目的[2-3]。筆者所在課題組在前期工作中獲得解淀粉芽孢桿菌菌株ck-05，為進一步將該菌株應用到實際生產中，對該菌株發酵液的抑菌活性及不同條件下的穩定性進行研究，旨在為將該菌株開發為生物農藥提供技術支撐。

1材料與方法

1.1試驗時間及地點

試驗于2019年在海南省文昌市文清大道496號椰子研究所實驗室（19°33′12″N，110°47′14″E）開展。

1.2供試菌株及培養基[4]

解淀粉芽孢桿菌ck-05和11種病原菌（檳榔炭疽病、椰子莖腐病、菜心炭疽病、油茶炭疽病、油棕心腐病、椰子灰斑病、板栗疫病、香蕉枯萎病、油茶葉斑病、檳榔心腐病、花生果腐病）均由中國熱帶農業科學院椰子研究所實驗室保藏。

LB（Luria-Bertani）培養基：5g酵母粉，10gNaCl，10g蛋白胨，18～20g瓊脂，1L水，pH值為7.0～7.2。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基：200g土豆，20g葡萄糖，18～20g瓊脂，1L水。

發酵培養基：20g葡萄糖，20g蛋白胨，0.8g無水氯化鈣，1.3gK2HPO4，0.2gMgSO4，0.8gMnSO4·H2O，pH為值7.0～7.2。

1.3無菌發酵液的制備[5]

將活化的菌株ck-05接入LB液體培養基中，30℃、200r/min搖床培養24h（D600nm>0.8）為種子液。將種子液分別按體積分數5%接入滅好菌的發酵培養基中，30℃發酵培養48h。發酵液10000r/min離心20min，上清液用0.22μm微孔濾膜過濾，得到菌株ck-05無菌發酵液。

1.4ck-05發酵液抑菌譜的測定

將10mLck-05菌株發酵液與90mLPDA培養基混合均勻，制成含菌株ck-05無菌發酵液的培養基平板。分別在平板中央接入11種不同的供試病原菌菌塊（5mm），以10mL無菌水為對照（CK）。置于28℃的恒溫培養箱中培養，待對照組菌落長滿培養皿時，采用十字交叉法測量各處理組菌落直徑，并計算無菌濾液的抑菌率[6-7]。

抑菌率=（對照菌落生長直徑-處理菌落生長直徑）/對照菌落生長直徑×100%。

1.5ck-05發酵液的穩定性測定

1.5.1熱穩定性

在40、60、80、100℃條件下，分別將ck-05菌株發酵液處理30、60、120min及121℃滅菌20min[8-9]，測定ck-05無菌發酵液對香蕉枯萎病的抑菌率，CK為不作溫度處理的發酵液。待觀察并測量各處理組菌落直徑，并計算抑菌率，計算方法同上。

1.5.2酸堿穩定性pH值設為1.0～13.0等13個梯度，用HCl和NaOH調整ck-05菌株無菌發酵液的pH值，靜置24h后調回發酵液原始pH值（pH值=7.2），測定ck-05無菌發酵液對香蕉枯萎病的抑菌率[9]。

1.5.3紫外線穩定性

將ck-05菌株發酵液置于距離30W紫外燈30cm處，紫外線照射時間分別設為10、20、30、40、50、60min等不同處理，測定ck-05無菌發酵液對香蕉枯萎病的抑菌率[10]。

1.5.4光照穩定性將ck-05菌株無菌發酵液在自然光下照射4、8、12、16、20、24h，測定ck-05無菌發酵液對香蕉枯萎病的抑菌率[10-11]。

1.5.5酶穩定性酶的終質量濃度為50mg/L，溫度設為37℃。用胃蛋白酶、蛋白酶K和胰蛋白酶處理ck-05菌株發酵液，分別處理0.5、1.0、1.5、2.0h，測定ck-05無菌發酵液對香蕉枯萎病的抑菌率，得出蛋白酶耐受性[10，12]。

2結果與分析

2.1ck-05菌株無菌發酵液的抑菌譜測定

由表1可知，ck-05菌株發酵液除對菜心炭疽病病菌的抑菌作用為43.47%外，對其他10種供試病原菌的抑菌率均達到50%以上，發酵液對香蕉枯萎病的抑制作用最強，抑菌率達82.22%，其次為花生果腐病病菌和椰子莖腐病病菌，抑菌率分別為79.44%和78.89%。由此可見，ck-05菌株發酵液抗菌范圍較廣。

2.2ck-05菌株發酵液的熱穩定性

以香蕉枯萎病病菌為指示菌，由圖1可知，經過不同溫度處理后，ck-05菌株發酵液仍具有較強的抑菌作用，熱穩定性較好。40、60、80℃處理不同時間后抑菌作用無明顯變化，但溫度高于80℃處理后發酵液抑菌活性明顯下降，100℃高溫處理120min后發酵液抑菌率為31.48%，經121℃高壓蒸汽滅菌后發酵液抑菌率僅為19.26%。當溫度達到100℃后，ck-05菌株發酵液的抑菌率明顯降低，這可能是由于高溫能夠使其抑菌活性物質結構發生變化，導致活性物質變性失活，最終使發酵液抑菌活性下降。

2.3ck-05菌株發酵液的酸堿穩定性

由圖2可知，ck-05菌株發酵液的抑菌活性對pH值較敏感。pH值為7時，其發酵液抑菌活性最大，pH值為5時，抑菌率為44.44%;pH值為3時，抑菌率為27.41%，pH值為1時，抑菌率僅為10.00%，與對照組CK相比分別下降34.43%、59.56%、85.25%，pH值為9時，抑菌率為50.00%、pH值為11時，抑菌率為22.59%;pH值為13時，抑菌率僅為7.78%，與對照CK相比分別下降26.23%、66.67%、88.52%。

2.4ck-05菌株發酵液的紫外線照射穩定性

紫外線照射穩定性是抑菌活性物質開發藥品、食品防腐劑的重要指標，若紫外穩定性差將會降低藥效[13]。由圖3可知，與對照CK相比，經紫外線照射30min內，ck-05菌株發酵液抑菌率下降較小;40min后隨著紫外線照射時間不斷延長，抑菌活性明顯降低，但紫外線照射60min時其抑菌率仍在40%以上。由此可知，ck-05菌株發酵液的抑菌活性受紫外線照射的影響較小，該結果與葛平華等的報道[8]一致。

2.5ck-05菌株發酵液的自然光照穩定性

由圖4可知，ck-05菌株發酵液在自然光照射0～24h后，其抑菌活性均無明顯變化。當持續光照24h后，ck-05菌株發酵液仍具有較強的抑菌活性，抑菌率為64.81%，與CK相比，其抑菌率變化不明顯，由此可見，ck-05菌株發酵液的抑菌活性受自然光照的影響較小。

2.6ck-05菌株發酵液的蛋白酶穩定性

由圖5可知，不同蛋白酶對ck-05菌株發酵液的抑菌活性影響不明顯，說明其發酵液的抑菌作用對3種供試蛋白酶均不敏感。

3討論與結論

李楊等研究結果表明，解淀粉芽孢桿菌ZJ01對蘋果輪紋病病菌有較強的抑制作用[14]。王曉輝等認為解淀粉芽孢桿菌K1發酵液可有效抑制灰霉病病菌的生長[15]。Caldeira等認為，菌株CCMI1051能較強地抑制哈茨木霉及根霉生長，抑菌作用分別為74.7%、99.8%[16]。張寶俊等從解淀粉芽孢桿菌LP-5中獲得1種對梨黑斑病病菌具有較強抑制作用的抗菌蛋白[17]。EvaArrebola等研究表明，菌株PPCB004能有效抑制青霉屬真菌的菌絲生長，其中對殼青霉菌的抑菌率達73.3%[18]。解淀粉芽孢桿菌的抑菌機制表現在不同的方面，不同的菌株其抑菌機制可能不同，但主要是產生抑菌活性物質。抑菌活性物質主要有甜蛋白、抗生素肽類物質、伊枯草菌素、芬枯草菌素、表面活性素、幾丁質酶、芽孢素類和細菌素等[19]。本研究發現，解淀粉芽孢桿菌ck-05發酵液對11種供試植物病原菌的菌絲生長均具有較強的抑制作用，尤其是對香蕉枯萎病的抑菌作用最強，抑制率達82.22%。以香蕉枯萎病病菌為指示菌，ck-05菌株發酵液在溫度低于80℃時具有較好的熱穩定性;對酸堿性條件比較敏感，pH值為6～8時具有較強的抑菌作用;紫外線和自然光照射下穩定性較好，對蛋白酶不敏感。該菌株發揮抑菌作用的具體活性物質及抑菌機制還有待進一步研究。

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