HPLC法同時測定對乙酰氨基酚口服混懸液中有關物質及防腐劑

北京市平谷區食品藥品安全監控中心（101200）范保瑞 張悅 張成志

上海強生制藥有限公司（200245）王正中

對乙酰氨基酚是世界衛生組織推薦的兒童最常用的解熱鎮痛藥之一[1]，常用的劑型有片劑、膠囊、口服混懸液及小容量注射液。對乙酰氨基酚口服混懸液目前國內僅有上海強生制藥有限公司生產，為紅色混懸液，黏稠，有甜味、果香味，為保證其口感狀態適合兒童服用，處方中含有潛溶劑、甜味劑、著色劑、防腐劑、助懸劑等大量輔料。

因對乙酰氨基酚二聚體（雜質A）在生產、儲存過程中極易產生，對氯乙酰苯胺（雜質B）為原料藥合成時引入的雜質[2]，具有潛在的基因毒性。此外，在現行對乙酰氨基酚原料藥及其制劑的質量標準和文獻中沒有以上兩種雜質的檢測方法。因此，筆者參考相關文獻[3-8]，建立高效液相色譜法，排除輔料干擾并測定其中有關物質及防腐劑含量。建立的方法具有專屬性強、準確、靈敏，可以用于對乙酰氨基酚口服混懸液的質量控制。

1 材料

1.1 儀器 LC20A型HPLC儀，包括SPD-M20A可變波長檢測器（PDA）、Labsolutions色譜工作站（日本島津公司）；CPA225D電子天平（德國sartorius公司）；SevenCompactpH計（瑞士Mettler-Toledo公司）。

1.2 藥品與試劑 對乙酰氨基酚對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號100018-201610，含量99.9%）、雜質A對照品（N-(5’-乙酰氨基-6,2’-二羥基-聯苯)-3-乙酰胺）（Organix公司，VM-459-170，含量89.4%）、雜質B對照品（N-(4-氯苯基)乙酰胺）（Organix公司，D1225CS，含量99.7%）、苯甲酸對照品（Organix公司，2DH0331，含量100%）、對羥基苯甲酸丁酯對照品（Organix公司，2EA0365，含量100%）、乙腈、三氟乙酸均為色譜純，水為純化水。

附表1 梯度洗脫程序

附表2 回歸方程和線性范圍

附表3 回收率試驗結果

附表4 樣品有關物質和防腐劑測定結果表

附圖1 高效液相色譜圖。A.對照品溶液色譜圖；B.供試品溶液色譜圖；C.輔料溶液色譜圖；D.空白溶劑色譜圖；1.對乙酰氨基酚；2.雜質A；3.苯甲酸；4.雜質B；5.對羥基苯甲酸丁酯

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：Hypersil GOLD C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動相：A為0.1%三氟乙酸溶液，流動相B為0.1%三氟乙酸的乙腈溶液，梯度洗脫，流速：1.0ml/min，柱溫：35℃，檢測波長：245nm，進樣量：20μl。梯度洗脫程序見附表1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液取對乙酰氨基酚口服混懸液，劇烈振搖使混合均勻，精密稱取適量（約相當于對乙酰氨基酚160mg），置100ml量瓶中，加稀釋劑50ml，振搖使溶解，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，濾過，棄去初濾液5ml，取續濾液，即得。

2.2.2 對照品溶液精密稱取對乙酰氨基酚對照品約32mg、雜質A對照品約32mg和雜質B對照品約6.4mg，置同一500ml量瓶中，加入乙腈50ml振搖使溶解，并用緩沖液定容至刻度，搖勻，作為有關物質對照儲備液。精密稱取苯甲酸對照品約169.5mg和對羥基苯甲酸丁酯對照品約25mg，置于同一50ml量瓶中，加入乙腈5ml振搖使溶解，并用緩沖液稀釋至刻度，搖勻，作為防腐劑對照儲備液。精密量取有關物質對照儲備液和防腐劑對照儲備液各5ml，置同一200ml量瓶中，加稀釋劑定容至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 系統適用性溶液取對乙酰氨基酚口服混懸液，劇烈振搖使混合均勻，精密稱取適量（約相當于對乙酰氨基酚160mg）和精密加入2.2.2項下的有關物質儲備液2ml，置100ml量瓶中，加稀釋劑50ml，振搖使溶解，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，濾過，棄去初濾液5ml，取續濾液，即得。

2.2.4 靈敏度溶液精密量取對照品溶液1ml，置10ml量瓶中，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.5 空白基質溶液取上海強生制藥有限公司提供的空白輔料混合物，按2.2.1項下方法配制空白輔料溶液。

2.2.6 破壞試驗儲備液取對乙酰氨基酚混懸液6.5g，置100ml量瓶中，加稀釋劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.7 稀釋劑的配制 0.01mol/L枸櫞酸緩沖液：取枸櫞酸鈉1.1g和枸櫞酸1.3g，加水溶解并稀釋至1000ml，用枸櫞酸鈉或枸櫞酸調節pH值至（4.00±0.05）。稀釋劑：0.01mol/L枸櫞酸緩沖液-乙腈（90∶10）。

2.3 靈敏度及系統適用性試驗 精密量取供試品溶液和對照品溶液各20μl，分別注入液相色譜儀，色譜見附圖1，結果：供試品溶液中主峰與相鄰雜質峰分離度均大于1.5。精密量取靈敏度溶液20μl，注入液相色譜儀，雜質B峰的信噪比不低于10，理論板數不低于5000。表明系統適用性試驗結果符合要求，本方法靈敏度較高，可用于雜質定量測定。

附圖3 （1）雜質A（對乙酰氨基酚二聚體）；（2）雜質B（對氯乙酰苯胺）

2.4 專屬性試驗

2.4.1 輔料干擾試驗取2.2.4項下的溶液，采用上述色譜條件進樣分析，結果空白輔料在本方法所考察的各物質峰處無色譜峰，輔料中泡泡糖香精、阿洛拉紅Ac、品紅酸D及高果糖漿的色譜峰較大，應予以扣除。故本方法采用Thermo Hypersil GOLD Aq（4.6mm×250mm，5μm）色譜柱，扣除4.5分鐘前的溶劑峰以及相對保留時間約為0.8、1.7、1.8、2.0、2.6、2.7的輔料峰。

2.4.2 破壞試驗 ①未破壞：取樣品6.4756g，置100ml量瓶中，加稀釋劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。②酸破壞：取樣品6.4219g，置100ml量瓶中，加1mol/L鹽酸溶液6ml，室溫放置5小時，加1mol/L氫氧化鈉溶液6ml，加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，即得。③堿破壞：取樣品6.4682g，置100ml量瓶中，加1mol/L氫氧化鈉溶液6ml，室溫放置5小時，加1mol/L鹽酸溶液6ml，加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，即得。④氧化破壞：取樣品6.4123g，置100ml量瓶中，加30%過氧化氫溶液6ml，室溫放置8小時，加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，即得。⑤高溫破壞：取樣品6.4550g，置100ml量瓶中，置105℃放置9小時，加稀釋劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。⑥光照破壞：取樣品6.4470g，置100ml量瓶中，置254nm紫外燈下照射9小時，加稀釋劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。以上各溶液按2.1項下的色譜條件進樣測定。破壞性試驗色譜見附圖2。由附圖2可見，各種因素破壞情況下，各峰分離度均大于1.5，雜質A峰純度均大于0.99999，表明在各種破壞條件下，已知成分峰與相鄰雜質分離度符合要求，方法專屬性較好。

2.5 線性關系考察 精密稱取對乙酰氨基酚對照品32.14mg，雜質A對照品36.18mg，雜質B對照品6.70mg，置同一500ml量瓶中，加乙腈50ml使溶解，用稀釋劑稀釋至刻度，混勻，作為有關物質儲備液。

精密稱取苯甲酸對照品170.52mg，對羥基苯甲酸丁酯對照品25.27mg，置同一50ml量瓶中，加乙腈5ml使溶解，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，作為線性試驗防腐劑儲備液。

用上述兩種儲備液稀釋制成一系列不同濃度的對照品溶液，依法測定。以檢測質量濃度（x,μg/ml）為橫坐標，峰面積（y）為縱坐標，進行線性回歸，線性范圍和回歸方程見附表2。

2.6 檢測限和定量限試驗 將2.2項下的對照品溶液取適量流動相稀釋后按2.1項下的色譜條件進樣，記錄色譜圖，以信噪比S/N=3∶1測得雜質A、雜質B，以及防腐劑苯甲酸、對羥基苯甲酸丁酯的檢測限分別為0.065ng、0.14ng、0.34ng、0.10ng；以信噪比S/N=10∶1測得各成分定量限分別為0.32ng、0.67ng、1.71ng、0.26ng。

2.7 回收率試驗 精密稱取對乙酰氨基酚對照品32.14mg，雜質A對照品36.18mg，雜質B對照品6.70mg，置同一500ml量瓶中，加乙腈50ml使溶解，用稀釋劑稀釋至刻度，混勻，作為有關物質儲備液。

精密稱取苯甲酸對照品170.52mg，對羥基苯甲酸丁酯對照品25.27mg，置同一50ml量瓶中，加乙腈5ml使溶解，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，作為防腐劑儲備液。

精密稱取樣品約6.4g，置100ml量瓶中，精密加入適量上述兩種儲備液，按供試品溶液配制方法進行溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制回收率試驗溶液，每個濃度配制3份，共9份溶液，分別測定回收率，測定結果見附表3。

2.8 耐用性試驗 筆者采用在同一臺色譜儀上分別只微小改變柱溫、流速、流動相中三氟乙酸濃度、梯度洗脫程序和不同色譜柱等唯一條件的方式，取2.2項下的系統適用性溶液進行試驗。其中，色譜柱分別選用了Waters A tlantis T3(4.6mm×150mm，3μm)；Waters XSelect HSS T3(4.6mm×250mm，5μm)和Thermo Hypersil GOLD aQ(4.6mm×250mm，5μm)在不同色譜儀上進行檢測。結果：選定的色譜條件進行微調及選用不同色譜柱后，所檢測到的雜質數目、出峰順序、分離效果和雜質及防腐劑峰面積均無明顯變化。

2.9 重復性試驗 按照2.2.1項下方法配制6份供試品溶液（樣品批號160831165），按2.1項下的方法測定，記錄色譜圖。結果：六份供試品測定結果一致，雜質A含量RSD=0.3%、雜質B未檢出，雜質總量RSD=0.6%、苯甲酸含量RSD=0.1%、對羥基苯甲酸丁酯含量RSD=0.1%。

2.10 穩定性試驗 按照2.2.1項下方法配制供試品溶液，分別在0、1、2、4、6、8、10、20h，按2.1項下的色譜條件測定，記錄色譜圖，以峰面積計算雜質，結果：A含量RSD=1.9%、雜質B未檢出、雜質總量RSD=1.6%、苯甲酸含量RSD=0.3%、對羥基苯甲酸丁酯RSD=0.4%，表明供試品溶液在20h內穩定。

2.11 樣品測定 按照2.2項下方法分別配制3份不同批號的供試品溶液，按2.1項下的方法測定，結果見附表4。

3 討論

3.1 雜質限度的確定 本方法所測雜質為現行標準未考察的新雜質，規定限度為雜質A不得過0.1%；雜質B（對氯乙酰苯胺）為原料藥合成時引入的雜質，因其具有潛在的基因毒性，故限值定為不得過0.005%。雜質分子式見附圖3。

3.2 溶解方法的探索 為保證取樣均一性，筆者嘗試取樣前要求超聲和劇烈振搖兩種預處理方法，考慮到超聲可能導致有關物質測定結果變化，故采用劇烈振搖混合方式使樣品均勻。取本品，劇烈振搖約20秒使分散均勻，稱取本品約6.4g（約5ml），置100ml量瓶中，加稀釋劑約50ml，振搖1小時。取出后用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，建議采用0.45μm的微孔濾膜過濾，但由于液體較黏稠，為保證過濾效果，采用8000轉/分鐘離心10分鐘后再過濾的方式，棄去初濾液5ml，取續濾液作為供試品溶液。

3.3 檢測波長的選擇 制備各組分的定位溶液，采用PDA檢測器，進行光譜掃描。結果表明：樣品主成分對乙酰氨基酚最大吸收在243nm，已知雜質含量最低的雜質B最大吸收為246nm。將檢測波長確定為主成分最大吸收和雜質B最大吸收之間且較靠近雜質B最大吸收的245nm，在此波長其他組分及破壞試驗產生的雜質也有較強吸收，選定的檢測波長可行。

3.4 色譜柱的選擇 本方法流動相中水的比例較高，宜采用耐水性強的色譜柱，筆者考察了2.8項下的三種色譜柱進行檢測。

綜上所述，本方法靈敏、準確、專屬性強、重復性好，可用于對乙酰氨基酚口服混懸液的質量控制。