門靜脈高壓癥標本庫的初步建立、質控及管理

趙肖靈，王繼濤，張小沖，張二鵬，李金龍，陳威，張昆鵬，張博，陳欣欣，劉登湘

（河北醫科大學附屬邢臺市人民醫院 門脈高壓研究中心，河北 邢臺 054001）

門靜脈高壓癥（portal hypertension，PH）是影響肝硬化患者臨床預后的重要因素，其嚴重程度決定了相關并發癥（如腹腔積液、食管胃靜脈曲張破裂出血、肝性腦病、肝腎綜合征等）的發生和發展[1-3]。據報道，全球患有肝硬化的人數超過3億[4]，因肝硬化導致的死亡人數達120萬[5]，且近年來死亡人數呈上升趨勢[6-7]。門靜脈壓力的持續升高是門靜脈血流由肝臟回流到下腔靜脈時受阻而引起的[8]。PH是肝硬化患者從代償期向失代償期過渡的特征性標志[9]，臨床顯著性PH患者常出現腹水、食管胃靜脈曲張破裂出血、細菌性腹膜炎、肝腎綜合征、肝性腦病

等[10-11]。

PH的診斷金標準為肝靜脈壓力梯度（hepatic venous pressure gradient，HVPG），其測量方式是有創的，且對操作者的水平要求較高[3，12]。因此，臨床上PH患者常因出現嚴重的并發癥如急性靜脈曲張破裂出血、頑固性腹水等以后，才得以確診[13]。而在無顯著并發癥的早期門靜脈高壓階段，HVPG檢測接受度更低，并且對于服用門脈降壓藥物，行內鏡、介入或外科手術治療后需動態監測門脈壓力情況的患者難以重復實施。因此，針對PH早期診斷、無創監測等方面一直是國內外學者的研究熱點之一。更重要的是，PH的診治模式不再是單一學科經驗式診療，而是逐漸轉變為多學科綜合協作診療模式。PH全病程治療方式將藥物、內鏡治療、外科手術、介入治療及肝移植等治療方式序貫結合，以實現優勢互補[11]。PH患者病程長、疾病涉及多個學科，會產生大量的臨床數據和各類臨床標本。因此，建立、維護和管理PH標本庫，標準、規范地保存PH樣本，對于PH發生的早期診斷和無創監測具有重要意義[14]。

生物標本庫是一類集中保護人類材料的生物庫，包括標本材料（組織、血液、尿液、唾液、腦脊液和大便等）、標本采集人信息（年齡、姓名、性別、疾病和采集日期等）以及后續采集人各種臨床資料（病因、診斷、合并癥、治療方式、影像學資料、檢驗學資料及隨訪信息等），用于疾病診斷、新藥研發和基礎研究等重要領域[15-16]。目前國內已建立了多個不同種類的腫瘤標本庫[17-19]，但PH的標本庫建立還未見報道，此標本庫的建立有助于為PH基礎與臨床提供實驗保障，為PH早期診斷和無創監測方面的研究奠定基礎。邢臺市人民醫院依托門脈高壓研究中心和中心實驗室的臨床資源和技術優勢，探索并成功建立PH生物樣本庫，并通過了相關質量控制，現總結報道如下。

1 材料和方法

1.1 生物標本入庫管理

1.1.1 標本來源：PH標本源自2018 年10 月至2020年6 月就診于本醫院的患者，納入標準：（1）年齡：18～75歲；（2）診斷為PH（臨床或病理診斷）；（3）簽署知情同意書。排除標準（符合以下任何標準之一）：（1）人體免疫缺損病毒及梅毒陽性者；（2）研究者認為不適于參與的任何醫學或非醫學狀況。

1.1.2 儀器設備：超低溫冰箱（海爾冰箱DW-86L490J），超低溫冰箱（中科美菱DW-HL100），生物安全柜（Thermo1389 SERIES A2），液氮罐（東亞YDS-35-125），離心機（Thermo Multifuge X3），電動移液器，手動移液器。

1.1.3 標本收集

（1）血漿、血清標本的處理及保存：血液標本由專職科研護士采集，采用無添加劑的無菌采血管和添加EDTA抗凝劑的無菌采血管各抽血3 mL，樣本采集后盡快以1 500 g/min離心10 min[20]，取血漿和血清各約1.5 mL，分別分裝為3管，每管0.5 mL左右。每個凍存管管壁上分三行，寫“樣本編號、患者姓名、采樣日期”三個信息，管蓋上寫“編號-標本類型。置凍存盒中放-80 ℃冰箱保存，避免反復凍融[21-22]。樣本分裝后原樣本采集管即刻按醫院醫療廢棄物處理流程處理。

（2）尿液標本的處理及保存：發放一次性手套、尿杯和無菌采集管給患者，并告知患者尿液采集要點：排前段尿液，收集中段尿液約半管左右，擰緊蓋子避免污染。收到尿液樣本后立即分裝為3 管并做標記，每管約1 mL。后續處理同前述“血漿、血清標本的處理及保存”。

（3）唾液標本的處理及保存：發放無菌采集管給患者，并告知患者唾液采集要點：隨機時間點，漱5口水，每口漱超過10 s，蓄唾液10 s后，吐入無菌采集管，收集3 mL左右，擰緊痰杯蓋子避免污染。工作人員收到唾液標本后立即分裝為3管，每管1 mL。后續處理同前述“血漿、血清標本的處理及保存”。

（4）組織標本的處理及保存：符合納入標準的患者，如果進行手術或穿刺活檢，在不影響病理診斷取材的前提下收集組織標本。標本離體后30 min內，取肝臟或脾臟等組織（盡量沖盡血液），將標本切成小塊（0.5 cm×0.5 cm，厚度＜0.5 cm）[14]。（1）新鮮保存的標本：將切好的標本放入凍存管，標記好后，迅速放入液氮快速冷凍，15 min后轉入-80 ℃冰箱保存，避免反復凍融；（2）福爾馬林保存的標本：將切好的標本放入裝有福爾馬林的管中，做好標記，常溫保存。

1.2 生物標本庫的管理

1.2.1 生物標本庫臨床數據采集及維護

（1）臨床數據完整準確：與醫院病理管理系統定制化對接，采集PH患者的臨床信息，包括年齡、性別、體質數、門脈高壓病因、體格檢查結果、實驗室指標、門脈系統解剖學資料（門脈直徑、肝內分支情況、有無血栓、脾靜脈及腸系膜上下靜脈匯合情況等）、門脈血流動力學指標（門靜脈流速、脾靜脈、腸系膜上靜脈流速、胃冠狀靜脈血流方向等）、肝脾彈性結果、胃鏡結果、病理結果、治療方案、治療結果等，及時留存患者影像學圖像（DICOM格式）。

（2）臨床數據及時更新：入庫患者如再次就診，應及時更新患者最新臨床數據資料，并由專人定期隨訪患者，補充患者預后及并發癥信息。

1.2.2 生物標本的質控：根據PH標本留存的研究目的，對新入庫的標本進行核酸、蛋白質、激素或微生物的質檢，出具檢測報告。放入標本庫未使用的標本每一年進行一次質檢，與最初的質檢報告進行對比，評估標本的質量[21-22]。

1.2.3 生物標本的信息化管理：PH標本庫管理采用海爾公司的標本庫冷鏈智能系統。

（1）空間管理有序、準確、自動化：實現樣本信息查詢、定位、數據批量導入和導出等，提高了空間利用率，確保取樣的準確性。

（2）智能化監管：溫濕度自動監測并與手機鏈接隨時隨地查看。

（3）保障數據安全和個人隱私：完善的權限管理功能和操作記錄功能，專人專管。

1.2.4 標本的銷毀：標本庫存放的標本存放時間超過一年，經過質檢評估不能使用的標本，需嚴格按照醫療廢物的流程進行處置，并做好交接和登記[19]。

1.3 統計學分析

采用Excel 2007 軟件對數據進行收集整理，采用SPSS 21.0 進行統計分析。對血清樣本保存前后DNA提取擴增結果進行正態性檢驗及方差齊性檢驗，血清樣本保存前后DNA提取擴增結果為非正態分布計量資料，比較采用配對秩和檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 標本收集情況

截至2020年6月共收集標本1 121份，其中組織標本13份，外周血標本434份，尿液標本337份，唾液標本337份。外周血標本中收集血清223份，血漿211份。所收集對象年齡為18～75歲，中位年齡50.6歲，其中男性301例（65.5%）。

2.2 質量控制

隨機選擇標本庫內為乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）所致門脈高壓（HBV-PH）的患者，采集其入庫時HBV-DNA擴增結果。從現有的血清樣本庫中，抽取保存期一年的HBV-PH患者入庫時HBVDNA擴增結果為陽性的38份標本，檢測其血清標本HBV-DNA有無降解。依據DNA提取和擴增試劑盒說明書提取和擴增血清標本的HBV-DNA，樣本擴增均做了3 次重復，采用配對秩和檢驗對標本保存前后HBV-DNA擴增結果進行分析，標本保存前后無統計學差異（P＞0.05）（見表1），表明標本存放一年后仍可滿足后續實驗要求。

表1 凍存一年前后乙肝標本DNA提取擴增結果分析

3 討論

PH是肝硬化患者的最重要并發癥之一，全球每年因肝病死亡的人數約有200 萬[7]。PH是肝臟血流動力學改變導致的疾病，是慢性肝病進展和死亡的重要危險因素之一。肝硬化門靜脈高壓患者在腹部外科手術中病死率更高，肝細胞癌合并PH患者的預后極差，因此控制門靜脈高壓可有效降低病死率[23]。有研究者通過收集血清標本，檢測標志物發現在肝硬化食管靜脈曲張但無出血史的患者中，TGF-β1與HVPG呈負相關[24]。因此，PH的早期發現和治療成為研究的熱點，科研機構對PH標本的需求也越來越多。

PH標本庫是支撐門靜脈高壓科學研究發展的有力保障，是促進轉化醫學研究的關鍵，能夠促進門靜脈高壓醫學研究的發展并創造社會和經濟效益，為人類的健康發展做出貢獻。此標本庫建立的優勢如下：（1）能夠促進PH病因學的研究；（2）是篩選新的標志物，找到新的治療手段和方法等轉化醫學的基石；（3）能夠推動門靜脈高壓研究產業化[25]。通過1年多的努力，目前此樣本庫已成功留存了門靜脈高壓血液標本434份，組織標本13份，尿液標本337份，唾液標本337 份。同時，定期每6 個月對血液（血清和血漿）標本、組織標本、尿液標本和唾液標本進行檢測，發現標本保存質量良好，能夠滿足后續實驗要求。此外，我們應用海爾公司標準版智能信息系統管理標本庫，每例標本均有相對應的完整臨床病歷資料和隨訪資料。

PH無創診斷方面的研究一直是肝病領域的研究熱點及難點，大多研究都是單中心的，而多中心、大樣本的研究則需建立一個標準、規范的標本庫。門靜脈高壓標本庫的質量控制是標本庫管理的關鍵，為科研提供合格標本的保障。本中心標本庫通過1 年多的運行經驗總結，標本庫管理應注意以下幾點：（1）標本的收集：標本的留存必須由經過培訓的專人負責，嚴格遵循標本入庫規范，尿液、唾液、血液和組織標本離體后應迅速處理，組織放置于液氮保存，時間不超過20 min，盡可能避免標本內核酸、蛋白質的降解及微生物狀態的改變[26]。（2）標本庫的日常維護：制定嚴格的標本庫管理及操作規范，定期檢測標本庫的冷鏈系統及裝置，保證器械設備溫控及監控報警完好，避免標本反復凍融。（3）標本質控：定期隨機抽取各類標本，檢測標本中DNA和RNA的完整性，驗證標本是否可用，保證標本能夠滿足科研要求，對于不能使用的標本，需嚴格按照醫療廢物的流程進行處置。總之，PH嚴重威脅人類的健康和生命，加強對PH基礎及臨床方面的研究十分必要，因此建立多中心甚至全國范圍內統一操作和質控標準的門靜脈高壓標本庫意義重大，能夠收集大量的臨床標本和資料，用于核酸、蛋白質、微生物等生物標志物等的研究，實現PH早期診斷和無創診斷。

綜上所述，我院初步建立了PH生物樣本庫，并進行了標準化的質量控制。后續，我院將繼續開展更多種類PH標本的收集和質控，便于深入研究PH發生發展機制，為開發新的PH診斷方法和治療方式提供保障。