宮頸癌患者血清長(zhǎng)鏈非編碼RNA-核富集轉(zhuǎn)錄體1的表達(dá)情況及臨床意義▲

劉 瑞 孟煥然 張 莉 馬亞楠 宋琳琳 張雪玉

(1 寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院心腦血管病醫(yī)院婦科，銀川市 750002，電子郵箱：hojj4752@163.com;2 寧夏回族自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院婦產(chǎn)科，銀川市 750002;3 寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院婦科，銀川市 750004)

宮頸癌作為女性最常見(jiàn)的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，具有較高的發(fā)病率，且該病在早期具有較強(qiáng)的隱匿性，患者普遍無(wú)典型臨床表現(xiàn)，這導(dǎo)致大部分患者確診時(shí)已處于中晚期，錯(cuò)過(guò)了手術(shù)根治的時(shí)機(jī)，預(yù)后不理想[1]。因此，早期有效的診斷對(duì)于提高宮頸癌臨床治療效果以及改善患者預(yù)后顯得尤為重要。目前，臨床上尚無(wú)高效且特異的腫瘤標(biāo)志物，這使得宮頸癌患者的早期診斷以及治療后隨訪難度加大[2]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)核富集轉(zhuǎn)錄體1(nuclear-enriched abundant transcript 1，NEAT1)是組成細(xì)胞核內(nèi)核旁斑的重要部分之一，其介導(dǎo)核旁斑核心結(jié)構(gòu)的構(gòu)成，且參與了一系列基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)[3-4]。有研究報(bào)告，lncRNA-NEAT1在食管鱗狀細(xì)胞癌、肝癌、膠質(zhì)瘤以及結(jié)直腸癌等多種腫瘤疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著極其重要的作用[5-6]。然而，關(guān)于其在宮頸癌患者中表達(dá)水平的相關(guān)研究并不多見(jiàn)。因此，本研究檢測(cè)宮頸癌患者血清lncRNA-NEAT1的表達(dá)并分析其臨床意義，旨在為臨床宮頸癌的早期診斷提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 納入2015年6月至2018年12月寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院心腦血管病醫(yī)院婦科收治的120例宮頸病變患者為研究對(duì)象。其中宮頸癌患者52例(宮頸癌組)，年齡23～70(44.69±9.56)歲；宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)患者68例(CIN組)，包括CIN Ⅰ級(jí)42例，CIN Ⅱ～Ⅲ級(jí)26例，年齡22～68(45.23±10.35)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有研究對(duì)象均經(jīng)手術(shù)病理組織活檢確診為宮頸癌或CIN；(2)入院前均未接受放療、化療等相關(guān)抗腫瘤治療；(3)既往無(wú)腫瘤病史，且近期無(wú)輸血史；(4)均擬行手術(shù)治療；(5)臨床病歷資料無(wú)缺失；(6)患者或其家屬已知情同意，并簽署同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他惡性腫瘤者；(2)心、肝、腎等重要臟器存在病變者；(3)無(wú)法正常交流溝通或伴有神經(jīng)系統(tǒng)疾病者；(4)正參與其他研究者。另選擇同期于我院進(jìn)行體檢的50例健康女性作為對(duì)照組，年齡21～69(45.19±10.06)歲。3組研究對(duì)象的年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本次研究已得到醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 研究方法 采集所有研究對(duì)象的清晨空腹靜脈血5 mL，4℃ 下以16 000 r/min離心10 min，吸取上清液裝入EP管內(nèi)，保存在-80℃冰箱中備用。采用RNA提取試劑盒(miRNeasy Serum/Plasma Kit，德國(guó)QIAGEN公司，批號(hào)：20141201)提取血清總RNA。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Prime-ScriptTMRT reagent Kit，日本Takara公司，批號(hào)：20150315)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄操作，獲取cDNA，反應(yīng)條件為37℃ 15 min、85℃ 5 s。以雙蒸水為空白對(duì)照，以cDNA為模板，采用SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司，批號(hào)：20150406]、美國(guó)ABI 7500 FAST實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行定量PCR反應(yīng)。NEAT1上游引物為5′-TGGCTAGCTCAGGGCT-3′，NEAT1下游引物為5′-TCTCCTTGCCAAGCTTCCTTC-3′；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)上游引物為5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，GAPDH下游引物為5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。PCR反應(yīng)體系為20 μL，包括cDNA模板1 μL、上游和下游引物各1 μL、Taq Mix 10 μL及無(wú)RNA酶水7 μL。反應(yīng)條件為：95℃ 30 s；95℃ 5 min,58℃ 30 s，72℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。待上述反應(yīng)結(jié)束后通過(guò)配套的計(jì)算機(jī)軟件讀取各反應(yīng)管內(nèi)的Ct值。血清lncRNA-NEAT1的相對(duì)表達(dá)水平采用2-△△Ct法計(jì)算。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，兩組間比較采用t或t′檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q法；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3組血清lncRNA-NEAT1相對(duì)表達(dá)水平對(duì)比 宮頸癌組及CIN組患者血清lncRNA-NEAT1的相對(duì)表達(dá)水平高于對(duì)照組；宮頸癌組患者血清lncRNA-NEAT1的相對(duì)表達(dá)水平高于CIN組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 3組血清lncRNA-NEAT1相對(duì)表達(dá)水平對(duì)比(x±s)

2.2 宮頸癌組患者血清lncRNA-NEAT1相對(duì)表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系 低分化患者的血清lncRNA-NEAT1相對(duì)表達(dá)水平高于中高分化患者(P<0.05)；其他不同臨床病理特征患者之間血清lncRNA-NEAT1相對(duì)表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 宮頸癌組血清lncRNA-NEAT1相對(duì)表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系(x±s)

3 討 論

由于lncRNA不具備編碼蛋白質(zhì)的能力，早期并未引起人們的關(guān)注[7]。近年來(lái)，隨著基因研究的逐漸深入，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)基因翻譯成蛋白質(zhì)的過(guò)程可能有多種調(diào)控序列參與，而lncRNA在多種生物學(xué)活動(dòng)中均起著至關(guān)重要的作用[8-10]，主要包括以下幾點(diǎn)：(1)抑制RNA聚合酶Ⅱ活性或參與染色質(zhì)重構(gòu)、組蛋白修飾，繼而對(duì)下游基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)；(2)通過(guò)對(duì)蛋白編碼基因上游啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)，繼而影響該基因的表達(dá)水平；(3)與蛋白編碼基因的轉(zhuǎn)錄本形成互補(bǔ)雙鏈，繼而影響mRNA剪切，形成不同剪切形式，進(jìn)一步導(dǎo)致該基因的表達(dá)異常等。研究顯示，lncRNA在肝癌[11]、結(jié)腸癌[12]以及乳腺癌[13]等組織中存在異常表達(dá)，且與腫瘤表型及患者預(yù)后有著密切關(guān)系。這提示lncRNA或可成為部分腫瘤疾病潛在的分子標(biāo)志物以及治療靶點(diǎn)，這為腫瘤的早期診斷以及早期治療提供了新的思路。

lncRNA-NEAT1是核旁斑重要結(jié)構(gòu)的組成部分，近年來(lái)有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，多種惡性腫瘤(如胃癌[14]、非小細(xì)胞肺癌[15])組織中存在lncRNA-NEAT1表達(dá)異常上調(diào)的現(xiàn)象。此外，有體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，lncRNA-NEAT1可以通過(guò)靶向上調(diào)下游癌基因(如CBX7、RTCB)的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性生長(zhǎng)和遷移[16]。此外，在三陰性乳腺癌細(xì)胞中l(wèi)ncRNA-NEAT1的表達(dá)上調(diào)能夠促進(jìn)細(xì)胞干性標(biāo)志物(如SOX4等)的表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，使腫瘤細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)移能力以及對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性[17]。但目前針對(duì)宮頸癌的lncRNA-NEAT1研究少見(jiàn)。本研究結(jié)果顯示，宮頸癌組及CIN組患者血清lncRNA-NEAT1的相對(duì)表達(dá)水平均高于對(duì)照組，宮頸癌患者血清中l(wèi)ncRNA-NEAT1的相對(duì)表達(dá)水平較CIN患者升高，這提示lncRNA-NEAT1表達(dá)上調(diào)參與宮頸癌的發(fā)生與發(fā)展。目前其表達(dá)上調(diào)的機(jī)制尚不清楚，可能與lncRNA-NEAT1的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控異常有關(guān)。Fan等[18]的研究表明，lncRNA-NEAT1受到微小RNA(microRNA，miRNA)-18a-5p在轉(zhuǎn)錄后水平上的抑制，腫瘤中miRNA-18a-5p的表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致lncRNA-NEAT1的穩(wěn)定性增高，引起lncRNA-NEAT1表達(dá)水平升高。

我們進(jìn)一步分析了宮頸癌患者血清lncRNA-NEAT1表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果顯示，血清lncRNA-NEAT1表達(dá)水平可能與宮頸癌分化程度有關(guān)(P<0.05),而可能與年齡、FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑無(wú)關(guān)(P>0.05)，這表明lncRNA-NEAT1可能參與調(diào)節(jié)宮頸癌細(xì)胞的分化過(guò)程。有研究表明，宮頸癌中l(wèi)ncRNA-NEAT1能夠作為分子支架結(jié)合miRNA-133a并抑制其功能，導(dǎo)致miRNA-133a表達(dá)水平下降，進(jìn)而引起其靶基因SRY盒轉(zhuǎn)錄因子4的表達(dá)升高，而SRY盒轉(zhuǎn)錄因子4又可激活核因子κB通路，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化[19]。

綜上所述，宮頸癌患者血清中l(wèi)ncRNA-NEAT1呈高表達(dá)，且與腫瘤分化程度相關(guān)，其或可成為宮頸癌的有效標(biāo)志物之一。本研究尚存在一定局限性，如樣本量較少，這可能使研究結(jié)果產(chǎn)生一定程度的偏倚。因此，在今后的研究中應(yīng)開(kāi)展更大樣本量的研究，以進(jìn)一步驗(yàn)證本研究結(jié)果。