食品中諾如病毒檢測技術研究進展

廖小艷 陳麗麗 白亞龍

(1. 上海市農業科學院農產品質量標準與檢測技術研究所，上海 201403；2. 南華大學公共衛生學院衛生檢驗系，湖南 衡陽 421000；3. 上海科立特農產品檢測技術服務有限公司，上海 201403)

諾如病毒(Norovirus，NoV)屬于杯狀病毒科諾如病毒屬，基因組長度約為7.4～7.7 kb，為無包膜單股正鏈RNA病毒，能廣泛地感染人、豬、鼠、牛等多種哺乳動物，是主要的食源性致病原，可引起以嘔吐、腹瀉為主的急性胃腸炎[1-3]。NoV包含3個開放閱讀框(Open Reading Frames，ORFs)，分別編碼非結構蛋白、衣殼蛋白(Virus particle 1，VP1)、微小結構蛋白。VP1由殼區(Shell domain，S區)和突出區(Protruding domain，P區)組成，P區又包含P1和P2亞區，P2亞區含有主要的中和表位，呈高度易變性[4-5]。NoV的基因型和基因組之間存在很大的抗原差異性，根據衣殼蛋白區和RNA多聚酶區核酸序列，可將NoV分為10個基因組(Genogroup，GⅠ～GⅩ)，其中GⅡ型是引起人體急性胃腸炎最主要的基因群，約有85%的NoV感染由GⅡ型導致[6]。NoV在世界范圍內均有流行，具有季節性高發、全人群普遍易感、高度變異、感染性強等特點。在中國，約有15%腹瀉兒童的血清抗體中檢出了諾如病毒，自2014年以來，諾如病毒造成的公共衛生事件顯著增加，極大地加重了疾病負擔[7]。

NoV主要經糞—口途徑傳播，污染的食品(如貝類等水產品、藍莓、生菜等果蔬)是常見的傳播媒介。食品中NoV含量低，且基質復雜，富含各種PCR抑制物，導致NoV難以富集檢出。目前，病毒富集純化仍是NoV檢測的關鍵點及難點，在尚無特效藥物及疫苗的情況下，開發高效準確的檢測方法對防止疾病傳播十分必要。文章擬闡述諾如病毒前處理環節及檢測的最新研究成果，囊括富集技術、核酸檢測、免疫學檢測，以及生物傳感器等。

1 諾如病毒的富集

食品中NoV含量低，且基質復雜，富含各種PCR抑制物，病毒富集純化一直是NoV檢測的瓶頸。有機絮凝沉淀法、膜過濾法、超濾濃縮等技術是目前NoV富集的主要方法，但這些富集方法是非特異性的，需要不斷優化濃縮條件，且各類分子檢測抑制物會隨NoV的富集而富集[8]。近年來，免疫(抗原—抗體)結合、病毒—受體結合、核酸適配體等特異性的NoV富集手段成為研究熱點。

1.1 基于抗原抗體反應的富集技術

免疫磁珠是一種基于抗原抗體反應的特異性病毒富集方法，借助磁珠偶聯的方式，利用針對特征性NoV的單克隆抗體或多克隆抗體來捕獲病毒顆粒，可從復雜的基質中高效分離和濃縮NoV[9]。Park等[10]通過將克隆表達出的GI-1型和GII-4型NoV的衣殼蛋白對兔進行免疫，制備了針對特定基因型NoV衣殼蛋白的多克隆抗體，并將該多克隆抗體與磁珠偶聯獲得了相應的免疫磁珠。利用上述制備的免疫磁珠聯合RT-PCR法對人工染毒草莓中GI-1型和GII-4型NoV進行檢測，其回收率分別為29.50%，14.14%，檢出限低至3～7個RT-PCR單位。Lee等[11]利用免疫磁珠分離(磁珠上偶聯兔抗人NoV多克隆抗體)和量子點分析技術建立了一種檢測新鮮生菜中諾如病毒的方法。該試驗比較了免疫磁珠分離和聚乙二醇病毒沉淀兩種方法的富集效率，兩種方法均從人工染毒的NoV生菜樣品中產生了可檢測到的擴增片段(213 bp)，但免疫磁珠法以10 min的孵育促進病毒沉淀，而聚乙二醇沉淀法需要更長的孵育時間(3 h)和額外的高速離心來沉淀病毒。

雖然免疫磁珠法可高效特異性富集NoV，但NoV抗原的高度變異性使其無法富集所有的NoV，往往需要與多種抗體或多價抗體偶聯以提高免疫磁珠法的適用范圍及性能[12]。

1.2 基于病毒—受體結合的富集技術

組織血型抗原(Histo-blood group antigens，HBGA)是一類分布于外周組織，可與人源NoV結合的受體，主要包括ABO、 Lewis和“分泌型”系統3種[13]。豬胃黏蛋白(Porcine gastric mucin-conjugate，PGM)被證明含多種HBGA(A型、H1型和Lewis抗原)，可與NoV廣譜結合[14]。Tian等[15]采用PGM偶聯磁珠以濃縮人工染毒食品樣本(牡蠣、草莓、樹莓和生菜)中NoV，該方法不僅提高了靈敏度，還可有效去除RT-PCR抑制劑。Wang等[16]通過將PGM包被在PCR反應容器上以捕獲分離病毒，并評估了熱和氯處理對NoV滅活的影響。此外，Suresh等[17]比較了ISO/TS 15216-1:2017方法與豬胃黏蛋白包被磁珠法(Porcine gastric mucin coated magnetic beads，PGM-MB)的病毒提取效率，并結合熱變性提取RNA，用于檢測人工染毒的新鮮海藻、羅勒、薄荷和菠菜中的人源NoV。數據表明，與ISO/TS 15216-1:2017相比，PGM-MB不僅能顯著縮短檢測時間，回收率也明顯升高，PGM-MB法從1∶10稀釋倍數的海藻中提取RNA的回收率高達(52.3±12.9)%。

HBGA可與絕大部分的人源諾如病毒結合，并且可以去除非致病性病毒顆粒的干擾，在NoV前處理中具有廣泛的應用前景，但HBGA特異性較低，與其他病毒(如輪狀病毒)之間也存在結合[18-19]。

1.3 基于適配體的富集技術

核酸適配體是一段可特異性識別并捕獲目標分子的核酸片段，為NoV富集提供了很好的思路[12]。與抗體相比，適配體具有成本較低、易于化學合成和修飾、不引起免疫反應等優點。此外，通過核酸適配體對NoV顆粒進行特異性捕獲，可采用簡單的洗滌去除分子檢測抑制物及樣品基質，提高檢測的靈敏度，避免假陽性、假陰性結果的產生[20]。Escudero-Abarca等[21]利用指數富集的配體系統進化技術篩選出4種能與GⅡ 2型人源諾如病毒廣泛反應的ssDNA核酸適配體，分別命名為適配體19、21、25和26，其中適配體25與病毒樣顆粒的結合親和力在1～5 mg/mL范圍內與市售抗體相當。當使用適配體25標記的磁珠結合RT-qPCR對人工污染的生菜中的NoV進行回收和檢測時，結果顯示，該方法檢測下限為10個RNA拷貝數/3 g生菜，捕獲率為2.5%～36.0%。

雖然適配體能特異性捕獲NoV顆粒，但目前缺乏能夠與所有NoV基因型廣泛結合的適配體，開發能與更多NoV基因型結合的適配體是解決問題的關鍵[12]。且與抗體、HBGA受體等相比，利用適配體對NoV進行特異性捕獲的研究也要少得多，研究者可進行相關研究，拓展這方面的應用。

2 核酸檢測

目前NoV檢測方法主要有電鏡法、免疫學檢測和核酸分子檢測技術等。常規電鏡觀察法具有靈敏度較低、對操作人員技術要求高、檢測費用高等缺點，極大地限制了其應用，現已逐漸淘汰，不再作為主流的檢測手段。NoV是生命物質，隨著分子生物學的長足發展，基于核酸的檢測得到了廣泛的研究與應用。基于核酸分子的NoV檢測方法主要有常規RT-PCR、巢式PCR、多重PCR、RT-qPCR，以及新興的數字PCR和二代測序技術。由于常規RT-PCR、巢式PCR、多重PCR等存在一些缺陷，逐漸被其他的方法所替代，在此主要對NoV檢測的“金標準”RT-qPCR及新興的PCR技術展開綜述。

2.1 RT-qPCR

RT-qPCR允許在單一反應中進行信號放大和擴增確認，通過實時監測熒光信號的增強達到定量的目的，具有靈敏度較高、特異性強等特點，是目前NoV檢測的“金標準”[22]。Rupprom等[23]對基于TaqMan探針，用于定量檢測GI和GII型NoV的RT-qPCR檢測法進行了評估。該方法對GII DNA標準品的靈敏度達103DNA拷貝數/mL，且未與其他常見腸道病毒產生交叉反應，具有良好的分析靈敏度。此外，Brassard等[24]采用RT-qPCR對田間灌溉草莓進行了NoV檢測，并評估其污染來源。該研究采用超濾濃縮的前處理方法，結果顯示GI型NoV 檢測范圍為3.0×103～5.0×101particles/g，這與其他新鮮產品(葉綠色和漿果)的研究一致。莫雪梅等[25]根據GII型NoV保守區域設計引物，建立了一種基于SYBR Green I染料的RT-qPCR方法，并用于貝類中NoV檢測。該方法檢測范圍為102～106拷貝，對甲肝病毒、輪狀病毒、星狀病毒等無交叉反應，靈敏度、特異性較好。

RT-qPCR是目前NoV檢測的常規方法，靈敏度較高、特異性強，但RT-qPCR無法區分致病性和非致病性諾如病毒顆粒，且食品樣品基質中存在的一些分子檢測抑制劑也會對檢測結果產生影響。所以，有一些研究會通過與其他技術結合消除此類問題，比如先用PGM對有活性的病毒粒子進行分離，然后進行RT-qPCR[15]。

2.2 數字PCR

微滴式數字PCR(Droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR)對樣品進行微滴化處理，含有待測靶核酸分子的微滴產生熒光信號，判讀為1，否則為0，根據陽性微滴的比例及泊松分布原理實現目標待測物的檢測。ddPCR克服了實時PCR需要依賴外部標準曲線和Ct值的局限性，逐漸成為一種替代的RT-qPCR的分析方法。作為一種第三代PCR技術，ddPCR具有靈敏度更高、不受基質抑制的優勢，是精準檢測含有大量PCR抑制劑的食品和環境樣品中低水平NoV的理想方法[26-27]。陳嘉茵等[28]利用RT-ddPCR技術對不同濃度人工染毒生菜樣品中的GII型NoV進行了檢測，結果顯示，RT-ddPCR檢測范圍為2.12～8.47×104拷貝/μL，其擴增效率為95.44%。在回收率檢測試驗中，抑制劑對結果無顯著性差異。該方法可避免抑制劑造成的“假陰性”結果，對低濃度受污染樣品進行有效檢測。王雪晴等[29]也采用RT-ddPCR建立了一種檢測冷凍草莓中GⅠ型、GII型NoV方法。該方法在10-6稀釋倍數的標準品中，實測拷貝數濃度低至1.8拷貝/μL，其靈敏度比RT-qPCR法高一個數量級。但當樣品濃度不在檢測限范圍內時，會因閾值線的設置的差別產生結果偏差[30]。此外，Tan等[31]采用一步法RT-ddPCR，以公開的引物和探針組JJV1F/JJV1R/JJV1P、JJV2F/COG2R/RING2分別用于檢測牡蠣中GⅠ 型、GII型NoV，并與RT-qPCR進行比較。結果顯示，RT-qPCR檢測NoV的靈敏度為1.88×102拷貝/μL，而RT-ddPCR定量檢測NoV的靈敏度為1.88×101拷貝/μL，是RT-qPCR的10倍。

越來越多的研究開始將數字PCR用于食源性致病微生物的檢測，并且顯示出一定的優勢，但目前儀器價格昂貴制約著該技術的實際應用，相信隨著科技的發展，儀器成本的下降，將會得到普及。

2.3 二代測序技術

二代測序(Next-generation sequencing，NGS)是基于PCR和基因芯片發展起來的一種DNA測序技術，該方法通過捕捉DNA復制過程中新添加的堿基所攜帶的特殊標記來實現測序，具有高通量、超高速、低成本的特點[32]。常見的技術平臺包括Roche的454 FLX、Illumina的Miseq/Hiseq等。常規的RT-PCR之后NGS只能簡單地檢測NoV RNA的存在，無法區分感染性和非感染性病毒顆粒。為避免非感染性病毒顆粒造成的假陽性，可對樣品進行RNase預處理。Imamura等[33-34]結合RNase酶解預處理和NGS技術對牡蠣樣品中基因型進行鑒定，證明了牡蠣中傳染性NoV的多樣性。牡蠣中含有幾種NoV基因型(GII.3、GII.4、GII.13、GII.16和GII.17)，不同基因型的檢出率和比例不同。Bartsch等[35]為了提供用于漿果中病毒檢測和鑒定的新方法，對曾造成大規模NoV腸胃炎暴發的草莓進行了NGS測試。研究證明，使用NGS技術可以鑒定自然污染的冷凍漿果中的人類致病性病毒，此次試驗產生了約2 900萬個序列，僅兩個序列顯示出與人源NoV同源。

二代測序技術可對諸多常見及罕見的NoV變異序列進行類別鑒定與分析，對于分型溯源具有不可比擬的優勢。然而，該方法仍需進一步優化以減少干擾序列，使得能夠在高度豐富的核酸的背景下方便且可再現地檢測出少量的人類致病性病毒序列，如通過對樣品進行DNases處理。

3 免疫學檢驗

免疫學檢驗主要基于抗原抗體反應，即用特異性的抗體來檢測樣本中的NoV。根據用于檢測或量化分析物的標記方法，可以將免疫學檢驗分為不同的類型，目前用于NoV檢測的免疫學方法主要有ELISA和免疫層析技術。

3.1 ELISA

ELISA是一種常見的免疫學檢測技術，它通過將抗原或抗體結合在固相載體表面，再加入酶標抗體或抗原，當抗原抗體發生特異性結合時，酶催化底物顯色以達到檢測的目的，ELISA具有檢測時間短、操作簡單等優點。已有許多商業ELISA試劑盒用于臨床樣本中NoV的檢測，如英國DakoCytomation公司開發的IDEIATM諾如病毒試劑盒、德國R-biopham公司開發的Ridascreen?諾如病毒試劑盒，但這些試劑盒的靈敏度和特異性范圍差異很大，且可能出現假陽性結果，制約了其發展應用。食品中NoV含量低，而ELISA的最低檢測濃度為104～106病毒顆粒/g，因此目前ELISA尚不能滿足食品樣本對NoV檢測的靈敏度要求[36]。

3.2 免疫層析技術

免疫層析技術以固定有檢測線(包被抗體)和質控線(抗抗體)的條狀纖維層析材料為固定相，測試液為流動相，是一種在免疫滲濾基礎上發展而來的新型免疫學檢測方法。當樣品中存在相應的抗原時，抗原會與抗體發生特異性反應，在檢測線出現可見的條帶而達到檢測目的。免疫層析具有檢測時間短、保質期長、成本相對較低等優點，一些商業免疫層析試劑盒也用于NoV檢測。Kumthip等[37]評估了最新版的RIDA?QUICK諾如病毒免疫層析試劑盒對臨床樣本中NoV檢測的敏感性和特異性，并與RT-PCR進行比較。結果顯示，該試劑盒具有較高的靈敏度和特異性，且與其他胃腸炎病毒無交叉反應。由于免疫層析技術具有檢測靈敏度和特異性較低的缺點，且對NoV的分型能力有限，因而主要用于臨床樣本中NoV的檢測。但可將其與其他技術聯合以提高檢測的靈敏度，從而滿足食品中NoV的檢測要求。

ELISA和其他免疫學檢測方法一樣具有檢測靈敏度和特異性較低的缺點，其檢測下限為104～106個病毒顆粒/g，不利于食品基質中NoV檢測。隨著新方法的出現以及與其他技術聯用，使得食品中NoV的檢測成為可能。如張捷等[38]通過將免疫層析法與近紅外熒光結合，制備了一種用于檢測貝類中NoV的便攜式試紙條；Alharami等[39]開發了一種基于納米材料的免疫分析方法，可實現對雞肉、黃瓜、生菜中NoV的檢測。免疫學技術與其他技術聯用不僅提高了檢測的靈敏度，滿足了食品中NoV的檢測要求，還使檢測設備更加便捷。核酸檢測、免疫學檢測用于諾如病毒檢測的評價匯總見表1。

4 生物傳感器

生物傳感器是一種可將生物響應轉換成可測量的光、電或物理信號的分析裝置，由生物刺激性材料識別元件和理化轉換系統組成。根據所使用的信號轉換器，生物傳感器可分為電化學、光學、壓電晶體和半導體生物傳感器等[40]。生物傳感器具有靈敏度高、成本低、分析速度快、高度自動化、集成化等特點，越來越成為研究的重點。

4.1 電化學生物傳感器

電化學生物傳感器是一種將生物識別轉換為電流、電位、阻抗等電信號的傳感平臺，具有低成本、高靈敏度的特點。Baek等[41]以NoroBP-nonFoul-(FlexL)2多肽為特異性生物分子結合劑，研制了一種用于高選擇性、高靈敏度檢測牡蠣樣品中NoV的電化學生物傳感器。NoroBP多肽通過噬菌體表面展示技術從隨機肽庫中篩選而出，能與NoV特異性結合。NoroBP-nonFoul-(FlexL)2多肽是以NoroBP為骨架，將兩個(GGGGS)連接子和一個(EKEKEKE)連接子插入到NoroBP中而成。此外，該多肽含有巰基，可在Au表面形成Au—S共價鍵，利用該特點可將多肽包被在電極上，電流信號隨NoV量的增加而遞減。該傳感器能對牡蠣中NoV進行高靈敏度、高選擇性檢測，檢測下限低至1.7拷貝數/mL。此外，Baek等[42]還開發了一種NoV特異性捕獲多肽功能化金納米修飾的二硫化鎢納米花電化學傳感平臺。當病毒與金納米顆粒修飾的二硫化鎢納米花結合時，通過阻止工作電極與氧化還原物之間的電荷轉移而提高了阻抗，阻抗值會隨著NoV量的增加而增加。利用電化學阻抗譜技術對傳感器檢測性能進行評估，該傳感器具有良好的選擇性和靈敏度，在牡蠣樣品中檢測限為6.21拷貝數/mL。

表1 諾如病毒檢測方法(核酸檢測、免疫學檢測)及評價?

除了利用多肽直接對NoV進行檢測外，也可利用NoV衣殼蛋白和諾如病毒樣顆粒進行間接檢測。如，Guo等[43]通過將制備的針對NoV衣殼蛋白的單克隆抗體偶聯在ITO/CdS電極表面，開發了一種光電化學生物傳感器，用于特異性和靈敏檢測NoV。該傳感器電極的光電流隨著NoV衣殼蛋白濃度的變化而變化，可在30 min 內以濃度依賴的方式檢測到低至2×10-10g/mL的NoV衣殼蛋白。此外，Lee等[44]利用外加磁力將金/磁性納米顆粒修飾的石墨烯沉積在叉指式鉑電極上作為電傳感通道，再與GII型NoV抗體偶聯，形成諾如病毒樣顆粒傳感平臺。該傳感平臺可通過測量電阻的變化來監測諾如病毒樣顆粒濃度的變化，在0.01 pg/mL～1.00 ng/mL 質量濃度范圍具有較高的靈敏度和特異性，檢測限為1.16 pg/mL。電化學生物傳感器作為一種高靈敏檢測病原體和污染物的新型工具，具有快速、現場診斷的NoV的潛力，可有效提高檢測的靈敏度，但其在實際中的應用尚未普及[45]。

4.2 光學生物傳感器

光學生物傳感器可分為基于熒光、吸收、反射、表面等離子體共振等，這些傳感器通常具有無標記、所需樣品量少、高靈敏度或特異性、可近乎實時地進行檢測的優點，在食品中諾如病毒檢測方面具有巨大應用潛力[46]。局域表面等離子體共振(Localized surface plasmon resonance，LSPR)是一種應用廣泛的傳感方法，具有響應速度快、衰變長度短的特點，可高靈敏度地檢測其表面的各種分析物[47]。Heo等[48-49]利用該技術開發了一種由親和肽引導的可檢測NoV衣殼蛋白和人源NoV的傳感器。親和肽通過從多價M13隨機肽庫中經生物篩選而來，可與NoV特異性結合，經ELISA鑒定，其與NoV的結合親和力為納摩爾級別。NoV衣殼蛋白含量與LSPR信號的吸光度呈正比，該傳感器的最低檢測限為0.1 ng/mL。但值得注意的是，利用LSPR進行傳感時需嚴格控制反應條件以減少非特異性結合，而當配體固定在傳感器表面后其天然構型可能會改變，這將影響與分析物的結合[50]。除表面等離子體共振型光學傳感器外，基于熒光的光學傳感器也被應用于食品中NoV檢測。Zhao等[51]從嗜熱菌中提取載色體，構建了一種以“ε-亞單位抗體—鏈霉素—生物素—探針”檢測系統的F0F1-ATPase生物傳感器，并成功用于食品中NoV檢測。該研究利用鏈霉素—生物素系統將設計的探針連接至傳感器，根據探針與NoV RNA的特異性結合可實現對NoV的檢測。與對照相比，該傳感器對NoV的熒光強度有顯著性差異，表明NoV被成功捕獲并連接到探針。所構建的生物傳感器可在1 h內完成NoV RNA檢測，靈敏度達0.005 ng/mL。此外，Adegoke等[52]開發了一種SiO2包覆合金化CdZnSeS量子點—分子信標納米傳感器，用于檢測GII型NoV。該研究利用核酸雜交原理，通過分子信標探針對NoV RNA進行特異性捕獲。該量子點分子信標探針可實現對低濃度NoV RNA的超靈敏檢測，最低檢出限為8.2拷貝數/mL。與傳統的分子檢測探針相比，該檢測系統具有快速、高特異、高靈敏度等優點。

除了電化學和光學生物傳感器之外，還有一些其他的生物傳感器也被用于NoV的檢測，如基于質量的生物傳感器(石英晶體微天平和微懸臂梁)、比色型生物傳感器、免疫傳感器等。與其他方法相比，生物傳感器具有靈敏度高、成本低、分析速度快、所需樣品量少等特點，在食品中諾如病毒檢測方面具有巨大應用潛力。雖然生物傳感器的開發極大地提高了檢測的靈敏度，但其在實際中的應用尚未普及，且當其利用配體捕獲NoV時，可能會改變配體的天然構象，從而影響與分析物的結合，因此仍需進一步改進。生物傳感器用于諾如病毒及其代替物檢測評價匯總見表2。

5 展望

在半個世紀的過程中，食品中NoV檢測和分析技術取得了極大的進展，人們對NoV的流行病學特征、基因分型、檢測和診斷有了更深入的認識。但目前NoV的檢測仍存在諸多挑戰，需要進一步的研究。首先，將含量極低的NoV從大樣本的復雜食品基質中提取富集一直都是NoV檢測的瓶頸環節，雖然已有一些基于靶向結合的特異性富集方法，但仍缺少能與不同基因型NoV進行廣譜結合的配體，因此開發具有廣譜配位性的配體對NoV的檢測極為重要[12]；其次感染性和非感染性病毒顆粒的區分對食品中NoV的檢測也十分關鍵。受損的衣殼蛋白雖然使NoV失去感染性，但其RNA依然存在，導致了核酸檢測假陽性結果的產生。目前，可以通過在PCR擴增之前加入核酸嵌入劑(如單疊氮乙錠和單疊氮丙啶)來達到區分感染性和非感染性病毒顆粒的目的[53]。核酸嵌入劑能夠穿透受損的衣殼蛋白，并與RNA共價結合，使得非感染性病毒不能進行RT-qPCR擴增從而區分；最后仍需進一步提升NoV檢測的靈敏度，實現快速、高通量檢測。核酸檢測耗時長，不利于實時檢測、免疫學檢驗的靈敏度和特異性通常較低，且對NoV的分型能力有限，而目前正在開發的可快速檢測的生物傳感器還沒有在實際應用中得以普及。雖然食品中NoV檢測研究已取得重大進展，但仍存在一些挑戰，需要繼續深入研究。

表2 諾如病毒及其代替物檢測方法(生物傳感器)和評價