過氧自由基對兔肉肌原纖維蛋白理化性質及結構的影響

陳曉思，賀稚非,2，王澤富，李洪軍,2*

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400716)2(重慶市特色食品工程技術研究中心，重慶，400716)

兔肉具有高蛋白低脂肪的特點，符合現代消費者對健康飲食的追求，受到越來越多消費者的青睞[1]。我國是世界上兔肉生產和消費大國，據聯合國糧農組織統計，2018年我國兔肉產量占世界兔肉產量60%以上，且兔肉的消費量在最近十年內迅速增長[2]。

兔肉的色澤、風味、質構等品質在貯藏期間會發生改變，這些品質與兔肉蛋白質及脂質氧化密切相關[3]。兔肉脂肪含量低，然而由于脂肪酸不飽和程度高，因此極易被氧化，容易導致肉的風味、色澤、質地和營養價值發生惡化，影響消費者對肉品的接受程度[4]。蛋白質作為肉的主要成分之一，對兔肉的品質具有重要影響，而肌原纖維蛋白(myofibril protein，MP)含量占兔肉蛋白質的60%左右，其結構及性質的變化對肉品質的影響占主導作用[5]。大量的研究表明，在肉品這個復雜的體系中，蛋白質氧化與脂質氧化相互促進[6-7]。過氧化物作為脂質氧化主要的初級代謝產物[8]，對蛋白氧化具有重要影響[9]。李學鵬等[10]用不同濃度的2，2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二鹽酸鹽[2,2′-azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride，AAPH]熱降解產生烷過氧自由基對草魚肌原纖維蛋白進行氧化處理，結果顯示烷過氧自由基能顯著影響草魚肌原纖維蛋白的熱聚集，影響其凝膠性質。尤翔宇等[11]用不同濃度的AAPH熱降解產生烷過氧自由基對米糠蛋白進行氧化處理，結果表明過氧自由基氧化可引起米糠蛋白生成聚集體，影響肌原纖維蛋白的溶解度、乳化性、起泡性、持水持油力等。此外還有AAPH熱解產生烷過氧自由基對豬肉肌原纖維蛋白[12]、酪蛋白[13]、大豆蛋白[14]影響的研究，但目前關于烷過氧自由基對兔肉肌原纖維蛋白結構與功能特性影響的研究相對較少。

為了對兔肉品質進行調控，探究脂肪氧化對蛋白質氧化的影響，通過誘導AAPH熱降解產生烷過氧自由基，并以不同的濃度作用于兔肉MP，研究不同氧化程度下兔肉肌原纖維蛋白結構及性質的變化，以期為深入研究肉類產品中脂質氧化和蛋白質氧化的相關性提供理論基礎，并為兔肉加工過程中的氧化控制、品質調控提供一定的參考價值，為全面提升兔肉精深加工技術提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

兔肉品種為伊拉配套系商品代(兔質量：2.3 ～2.6 kg)，來自重慶阿興記原種兔養殖基地。按商業規范模式屠宰，去皮、去頭、去內臟后，放入冷藏箱(約為6 ℃)，在5 h內運回實驗室。置于4 ℃的條件下排酸24 h后，分割出背最長肌，用保鮮袋密封，然后放置在-20 ℃冰箱中貯藏。氫氧化鈉、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、牛血清蛋白、AAPH，磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉、氯化鎂、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2 Na)、疊氮化鈉(NaN3)、2，4-二硝基苯肼、鹽酸胍、2-硝基苯甲酸、尿素、溴酚藍、鹽酸、十二烷基磺酸鈉、考馬斯亮藍、醋酸、甲醇，均為分析純，成都市科龍化工試劑廠；實驗用水為超純水。

1.2 儀器與設備

電子分析天平，賽多利斯科學儀器有限公司；5810型高冷凍速離心機，德國Eppendorf公司；UV-1700紫外-可見分光光度計，日本島津儀器有限公司；超低溫冰箱，青島海爾集團；XHF-D內切式勻漿機，寧波新芝生物科技股份有限公司；DSC 4000差示掃描量熱，美國Perkin Elmer公司；ZEN3690馬爾文激光粒度分析儀，英國馬爾文儀器公司；DSC 4000拉曼光譜儀，美國賽默飛世爾科技公司；日立F-2500熒光分光光度計，日本日立公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 肌原纖維蛋白提取

肌原纖維蛋白的提取參照PARK等[15]的方法。兔肉背最長肌在4 ℃條件下解凍24 h，然后用絞肉機攪碎。將攪碎的兔肉與20 mmol/L磷酸緩沖液(pH 7.2，其中包含0.1 mol/L NaCl、1 mmol/L MgCl2和1 mmol/L EDTA-2 Na)按1∶4(g∶mL)混合，然后以10 000 r/min轉速均質1 min，均質液在8 000 r/min、4 ℃離心15 min。去除上清液，加入提取液，并重復上述均質和離心步驟3次。之后加入20 mmol/L磷酸緩沖液(pH 6.25，其中包含0.1 mol/L NaCl)，并按上述條件均質、離心處理。移除上清液后，加入100 mL磷酸鹽緩沖液(pH 6.0)并勻漿。將均質液用 4層紗布過濾。隨后在8 000 r/min、4 ℃條件下離心15 min，沉淀為肌原纖維蛋白樣品。

1.3.2 反應體系制備

用磷酸鹽緩沖液(20 mmol/L，pH 6.0，含有0.5 mg/mL NaN3)溶解肌原纖維蛋白，然后加入不同濃度的AAPH溶液，使蛋白質濃度最終濃度為20 mg/mL，溶液中AAPH的最終濃度為0、1、5、10、15和20 mmol/L。將得到的混合溶液分別裝入廣口試劑瓶，將試劑瓶放入恒溫搖床中，在37 ℃條件下避光反應18 h。反應結束后將樣本溶液離心(4 ℃、15 min、8 000 r/min)。然后用超純水洗滌沉淀物2次，在上述條件下離心除去殘余的AAPH。

1.3.3 肌原纖維蛋白化學與結構變化測定

1.3.3.1 氨基酸側鏈修飾

羰基測定：羰基的測定參照CHEN等[16]的方法。在370 nm波長處測定吸光度，巰基含量根據摩爾消光系數計算求得，計算方法如公式(1)所示：

(1)

式中：A370為370 nm波長處的吸光度；c代表蛋白質質量濃度，mg/mL。

總巰基測定：參考GAN等[17]的方法測定蛋白質總巰基含量。在412 nm波長處測定吸光度，巰基含量根據摩爾消光系數計算求得，計算方法如公式(2)所示：

(2)

式中：A412為412 nm波長處的吸光度；c代表蛋白質質量濃度，mg/mL。

游離氨測定：參考LYU等[18]的研究方法進行測定。將200 mg鄰苯二甲醛溶于2 mL無水乙醇，隨后將溶液轉移至128 mL Na2B4O7緩沖液中(100 mmol/L，pH 9.75，含有β-巰基乙醇0.5 mL、10% SDS溶液12.5 mL)，隨后用蒸餾水將溶液定容至250 mL，得到鄰苯二甲醛(ortho-phthalaldehyde，OPA)溶液。將1 mg/mL 的肌原纖維蛋白溶液按照體積比1∶6與OPA溶液混合，35 ℃反應2 min后，于340 nm測定吸光度，以甘氨酸作標準曲線計算MP中游離氨含量。

1.3.3.2 肌原纖維蛋白二級結構測定

拉曼光譜測定：肌原纖維蛋白二級結構的變化利用拉曼光譜進行測定。用磷酸鹽緩沖液(20 mmol/L，pH 6.0)將反應后的肌原纖維蛋白樣本濃度調至20 mg/mL，然后利用拉曼光譜儀測定，光譜測定范圍500～3 000 cm-1，然后利用Peak fit軟件在1 600～1 700 cm-1范圍進行分峰擬合。

1.3.3.3 肌原纖維蛋白三級結構測定

內源性熒光：用磷酸鹽緩沖液(20 mmol/L，pH 6.0)將肌原纖維蛋白溶液濃度稀釋至0.5 mg/mL，用熒光分光光度計記錄300～400 nm的光譜，激發波長為295 nm，掃描速度為1 500 nm/min。

表面疏水性：肌原纖維蛋白用磷酸鹽緩沖液(20 mmol/L，pH 6.0)稀釋至5 mg/mL。隨后，取1 mL的稀釋液與0.2 mL濃度為1 mg/mL的溴酚藍(bromophenol blue，BPB)溶液混合。同時制備對照組樣品，即取1 mL磷酸鹽緩沖液加入0.2 mL的溴酚藍溶液。所有樣品在25 ℃的條件下振蕩10 min后離心(5 000 r/min，15 min，4 ℃)。取0.4 mL上清液，加入3.6 mL磷酸鹽緩沖液(20 mmol/L，pH 6.0)稀釋，在595 nm測定吸光度。以肌原纖維蛋白與BPB結合量(μg)表示表面疏水性，計算如公式(3)所示：

(3)

式中:A1為對照組于595 nm處吸光度;A2為處理組于595 nm處吸光度。

肌原纖維蛋白熱穩定性測定：通過差示掃描量熱儀DSC 4000進行肌原纖維蛋白熱穩定性測定。參照LYU等[18]的方法，用磷酸鹽緩沖液(20 mmol/L，pH 6.0)將蛋白質溶液稀釋至20 mg/mL，取60 μL稀釋好的蛋白溶液加入鋁坩堝，然后密封。然后以每分鐘5 ℃的加熱速率將溫度從30 ℃加熱到100 ℃，以空白坩堝為對照，利用Trios軟件計算變性溫度(Td)和焓變(ΔH)。

紫外吸收測定：用磷酸鹽緩沖液(20 mmol/L，pH 6.0)將肌原纖維蛋白溶液濃度稀釋至0.5 mg/mL。稀釋后的肌原纖維蛋白用紫外分光光度計測定其在230～320 nm處的紫外吸收光譜。

1.3.3.4 肌原纖維蛋白溶解度測定

用磷酸鹽緩沖液(20 mmol/L，pH 6.0)將肌原纖維蛋白稀釋至5 mg/mL，在4 ℃，8 000 r/min條件下離心15 min，測定離心后上清液蛋白濃度，同時測定離心前蛋白濃度，溶解度計算如公式(4)所示：

(4)

1.3.3.5 Zeta電位測定

雪后洗車一定要及時，即使天氣預報顯示未來的幾天內還會下雪，也不要拖著不洗車。只要被雪覆蓋了，就要馬上用清水將雪沖掉。因為雪中含有腐蝕成分，無論是漆面、底盤還是輪胎、輪轂，長期被雪覆蓋都會造成傷害。此外，露天洗車輛時，清水很容易灌進鎖眼，這時因雪后天氣寒冷，特別容易把鎖芯凍住。因此洗車前，最好能用膠布把鎖眼貼住，以防止進水。用洗車機洗車，水霧均勻，門被凍住的機會比較少。如果真的凍住了，用打火機把鑰匙燒一下，就很容易把凍住的車鎖打開。

參照SHEN等[19]的方法，將肌原纖維蛋白溶液稀釋至1 mg/mL， 將溶液注射到Zeta電位池(DTS1070)，在25 ℃下測量。

1.3.3.6 肌原纖維蛋白色澤測定

將肌原纖維蛋白溶液離心(4 ℃，15 min，10 000 r/min)，得到肌原纖維蛋白膏狀固體，使用色度計(UltraScan PRO)進行測定，光源為D65，測量區域直徑為10 mm，測量角為10度，在25 ℃條件下測量，記錄L*，a*，b*值。

1.3.3.7 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis, SDS-PAGE)

參考JIA等[20]的方法并適當修改。用磷酸鹽緩沖液(20 mmol/L，pH 6.0)將肌原纖維蛋白稀釋至2 mg/mL，將MP溶液與Buffer按體積比1∶3混合，然后將混合液在沸水條件下加熱5 min，離心(6 000 r/min、4 ℃、5 min)，取上清液10 μL，Maker 5 μL，注射至5%濃縮膠、10%分離膠組成的凝膠中，在電壓為60 V的條件下進行電泳測定。

1.4 數據分析

所用的實驗單獨重復3次，數據以平均值±標準差(SD)表示。采用Matlab(2016b)軟件分析并作圖，采用SPSS軟件對數據進行統計分析。顯著差異水平設置為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 AAPH濃度對兔肉MP氨基酸側鏈修飾的影響

2.1.1 AAPH濃度對兔肉MP羰基含量影響

2.1.2 AAPH濃度對兔肉肌原纖維蛋白總巰基含量影響

巰基是MP中最敏感、反應活性最高的基團，因此含硫氨基酸殘基最容易受到氧化，如圖1所示，巰基的變化與羰基的變化呈現相反的趨勢。對照組巰基含量為56.10 nm/mg MP，隨著AAPH濃度上升，巰基含量呈現顯著的下降趨勢(P<0.05)，當AAPH濃度達到20 mmol/L，巰基含量為31.93 nm/mg MP，降低了43%。在氧化條件下，自由基能從半胱氨酸的巰基獲得氫原子，產生的巰基自由基會進一步攻擊其他的巰基，形成二硫鍵；或者進一步和其他基團反應，形成其他共價交聯[22]。巰基是維持蛋白質結構一種重要的作用力，巰基含量的降低意味著蛋白質結構和功能發生改變。

2.1.3 AAPH濃度對MP游離氨含量的影響

氨基酸殘基上的氨基對自由基具有高度反應性，容易被氧化轉化為羰基。MP游離氨含量隨AAPH濃度增加的變化如圖1所示。隨著AAPH濃度的上升，MP游離氨含量下降。此結果和羰基含量的上升相互對應。由于自由基對蛋白質進行氧化修飾，氨基酸殘基氧化轉化為羰基。同時由于氧化使蛋白三級和二級結構發生變化，隱藏在蛋白質內部的疏水性氨基酸殘基得到暴露，被自由基進一步氧化，造成游離氨含量下降，羰基含量上升。

2.2 AAPH濃度對MP二級結構的影響

為了進一步說明AAPH對蛋白質結構的影響，研究測定MP的拉曼光譜，并對光譜進行分峰解析。不同濃度AAPH處理的MP的拉曼光譜如圖2所示，MP樣品特征吸收峰有800～900 cm-1，1 200～1 500 cm-1，1 600～1 700 cm-1和2 900～3 000 cm-1，其中酰氨Ⅰ區主要用來分析蛋白質二級結構。蛋白質的二級結構變化趨勢如圖3所示，隨著AAPH濃度的升高，α-螺旋和β-轉角呈現下降趨勢，而無規則卷曲和β-折疊則呈增長趨勢，ZHOU等[23]研究發現，不同氧化程度油脂對魚肌原纖維蛋白結構有影響，油脂氧化程度越高，蛋白質的α-螺旋含量越低，這個結論與本研究所得到的結果一致。α-螺旋結構主要依靠蛋白質分子內的氫鍵維持，而自由基攻擊蛋白質的氨基使得蛋白質分子內氫鍵減少，從而導致蛋白質去折疊化。此結果與游離氨、表面疏水性以及溶解度的變化相互印證。

圖2 不同濃度的AAPH對MP拉曼光譜的影響Fig.2 Effect of different concentrations of AAPH on MP Raman Spectra

圖3 不同濃度的AAPH對MP二級結構的影響Fig.3 The effect of different concentrations of AAPH on the secondary structure of MP

2.3 AAPH濃度對MP三級結構的影響

2.3.1 AAPH濃度對MP表面疏水性的影響

維持蛋白質三級結構和蛋白質構象很重要的一種作用力是表面疏水作用力，表面疏水性的改變可以直接反映蛋白質結構的變化。由圖4可以看出，表面疏水性隨著AAPH的濃度增加呈顯著上升趨勢(P<0.05)，并于20 mmol/L達到最高，比未氧化組升高了44%，這是因為在過氧自由基攻擊下，蛋白質巰基被氧化，其二級結構發生改變，使蛋白質內部疏水性氨基酸暴露出來，最終導致蛋白質表面疏水性增加。NYAISABA等[24]的研究也表明，在自由基氧化條件下，魷魚肌原纖維蛋白會發生去折疊化，使表面疏水性增加，且表面疏水性與自由基濃度呈正相關，這與本研究結果一致。

2.3.2 AAPH濃度對MP紫外吸收光譜及內源性熒光的影響

芳香族氨基酸側鏈具有紫外吸收特性，因此紫外光譜的變化可以反映蛋白質構象的改變。如圖4所示，未添加AAPH的MP在280 nm左右有吸收峰，隨著AAPH濃度的上升，吸收峰呈現降低趨勢，而且AAPH濃度為20 mmol/L時，處于280 nm附近的峰消失。這一結果說明蛋白質中的芳香族氨基酸(酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)被氧化。兔肉中色氨酸含量很高，而色氨酸極容易被氧化，WANG等[22]研究發現兔肉MP側鏈色氨酸的氧化會導致紫外吸收峰的降低甚至消失，這與本研究結果一致。

為了進一步證明MP色氨酸發生氧化，對氧化后MP內源性熒光進行測定，蛋白質的熒光主要由色氨酸貢獻。圖4展示了不同濃度AAPH處理后MP熒光的變化，熒光光譜顯示MP熒光在335 nm處有吸收峰，而且熒光強度隨著AAPH濃度增加逐漸降低。色氨酸屬于疏水性氨基酸，一般位于蛋白質內部，添加AAPH會導致色氨酸的熒光降低，這表明蛋白質結構展開，疏水性的色氨酸被暴露，從而被氧化。相關研究也表明在自由基攻擊下，蛋白質發生去折疊化，疏水性增加，游離氨含量降低，羰基含量上升[25-26]。

a-AAPH濃度對MP表面疏水性的影響;b-AAPH濃度對MP紫外吸收光譜的影響;c-AAPH濃度對MP熒光光譜的影響圖4 不同濃度的AAPH對MP三級結構的影響Fig.4 The effect of different concentrations of AAPH on the tertiary structure of MP

2.3.3 AAPH濃度對MP熱穩定性的影響

蛋白質氧化會導致其結構和氨基酸的變化，這會引起MP成分中肌球蛋白和肌動蛋白熱變性溫度的變化。如表1所示，未氧化的MP具有兩個變性溫度57.91 ℃和78.08 ℃，分別對應肌球蛋白熱變性溫度Td1，和肌動蛋白熱變性溫度Td2，它們的焓變分別對應為ΔH1和ΔH2。隨著AAPH濃度增加，變性溫度和焓變呈現減小趨勢，當AAPH濃度增加到10 mmol/L，肌球蛋白變性峰消失，而當AAPH濃度增加到15 mmol/L，肌動蛋白熱變性峰消失。此結果說明氧化會導致蛋白質變性，且肌球蛋白比肌動蛋白更加容易氧化變性。這個結果與CHENG等[26]的結論一致。

表1 不同濃度的AAPH對MP熱穩定性的影響Table 1 The effect of different concentrations of AAPH on the thermal stability of MP

2.4 AAPH濃度對MP溶解度的影響

溶解度是MP氧化程度的一個重要參數，對蛋白質的功能特性有較大影響。MP溶解度隨AAPH濃度增加的變化趨勢如圖5所示，隨AAPH濃度的增加，MP溶解度逐漸下降，與AAPH濃度呈負相關。當AAPH濃度為0 mmol/L，MP的溶解度為10.14%。當AAPH濃度分別增加至1、5、10、15 和20 mmol/L，MP溶解度分別為8.58%，7.22%，6.43%，5.07%和4.1%。ZHOU等[27]研究發現米糠蛋白在過氧自由基氧化條件下，蛋白溶解度隨著AAPH濃度增加而下降，與本研究的結果一致。溶解度的降低進一步說明蛋白質在自由基氧化條件下發生去折疊化，疏水性基團暴露，并產生交聯，蛋白質分子聚集，此結果與羰基、巰基以及表面疏水性的變化趨勢相對應。

圖5 不同濃度的AAPH對MP溶解度的影響Fig.5 The effect of different concentrations of AAPH on the solubility of MP

2.5 AAPH濃度對MP Zeta電位的影響

圖6展示了Zeta電位隨著AAPH濃度增加的變化情況，肌原纖維蛋白的等電點大約為pH 4，因此MP在pH為6的緩沖溶液中帶負電，未添加AAPH的肌原纖維蛋白的Zeta電位絕對值最大，而隨著AAPH濃度的增加，電位絕對值逐漸下降。蛋白質帶電荷主要是因為氨基酸帶電荷，蛋白質在過氧自由基的攻擊下，一些氨基酸被氧化使得電荷得到中和，導致蛋白質電荷絕對值降低，由于所帶電荷絕對值的減少，蛋白質之間靜電相互作用力減小，這也是蛋白質在氧化后溶解度降低的原因之一[28],此結果和游離氨基溶解度的變化相互印證。

圖6 不同濃度的AAPH對MP Zeta電位的影響Fig.6 The effect of different concentrations of AAPH on MP Zeta potential

2.6 AAPH濃度對MP色差的影響

肉在氧化過程中，色澤會發生變化，這是由脂肪氧化和蛋白質氧化共同決定的。一般而言，氧化會導致肉的紅度值a*下降，黃度值b*上升。a*下降主要是肌紅蛋白氧化導致，而b*上升目前主要認為是脂肪氧化產物丙二醛導致。MP的色差變化如表2所示，隨著AAPH濃度的增加，L*和b*呈現增加趨勢，而a*則展示下降趨勢。蛋白質是肉的主要成分，肌原纖維蛋白占總蛋白60%左右，因此肌原纖維蛋白的色差變化對肉的色差影響很大，此結論從機理上說

表2 不同濃度的AAPH對MP色差的影響Table 2 The effect of different concentrations of AAPH on the color of MP

明兔肉在貯藏過程中b*值的上升不僅是因為脂肪氧化產物丙二醛的產生，很大一部分的原因是肌原纖維蛋白的氧化,因此減少蛋白氧化可以控制肉的色澤劣變。

2.7 SDS-PAGE

SDS-PAGE被用來分析添加不同濃度AAPH后MP的交聯以及分子質量的變化情況。圖7展示了不同濃度的AAPH對MP凝膠電泳的影響，圖7-a展示了添加β-巰基乙醇的電泳圖，圖7-b展示了未添加β-巰基乙醇的電泳圖。從圖7-b可以看出，在凝膠的頂部進樣口有條帶聚集而且隨著AAPH濃度的上升，聚集條帶加深，同時肌球蛋白重鏈和肌動蛋白條帶隨著AAPH濃度增加，逐漸變淺，這些結果表明在自由基氧化條件下，蛋白質發生交聯聚集。FUENTES-LEMUS等[13]研究發現過氧自由基誘導酪蛋白氧化，導致酪蛋白聚集分子質量增加，同時通過高效液相色譜質譜檢測到了二聚酪氨酸、二硫鍵聚合物以及其他聚合物，當在MP中添加β-巰基乙醇后，聚集在頂部的條帶依然存在，這說明在氧化條件下蛋白質的交聯不僅存在二硫鍵，還存在其他的共價交聯。隨著AAPH濃度增加，肌球蛋白重鏈和肌動蛋白條帶逐漸變淺。

a-添加β-巰基乙醇;b-未添加β-巰基乙醇圖7 不同濃度的AAPH處理對MP凝膠電泳的影響Fig.7 The influence of different concentrations of AAPH on MP gel electrophoresis注：1、2、3、4、5、6分別表示AAPH濃度為0、1、5、 10、15、20 mmol/L

3 結論

采用不同濃度AAPH熱解產生的過氧自由基對兔肉MP進行氧化，探討不同濃度的過氧自由基對兔肉MP的影響。研究表明隨著AAPH濃度的升高，蛋白的巰基含量、內源性熒光強度、溶解度、游離氨含量、熱穩定性和α-螺旋含量呈下降趨勢，而羰基含量、表面疏水性，L*值和b*值呈上升趨勢。SDS-PAGE結果進一步表明，兔肉MP在過氧自由基氧化條件下，蛋白分子發生交聯聚集。綜上所述，脂質氧化的初級代謝產物過氧自由基能夠顯著促進蛋白質氧化，從而改變其性質，因此在肉品質調控中，可以通過控制脂肪氧化來調節蛋白質氧化，研究結果為兔肉后續加工中控制蛋白質氧化提供理論依據。