類蛋白反應及其在肉類中的應用

侯鈺柯，石金明，曾憲明，尹家琪，田惠鑫，白云，唐長波，韓敏義,*，徐幸蓮

1(南京農業大學 食品科技學院，江蘇 南京，210095)2(農業部肉品加工重點實驗室 江蘇省肉類生產與加工質量安全控制協同 創新中心，江蘇 南京，210095)3(溫氏食品集團股份有限公司，廣東 云浮，527400)

類蛋白反應是在合適的蛋白酶催化下，將濃縮的蛋白水解物質合成凝膠狀物質的反應，可用于合成一些高分子質量的類蛋白物質[1]。水解反應是類蛋白反應的第一步，是原料蛋白經酶水解成濃度較低的蛋白水解物。所以發生水解可能發生了類蛋白反應。類蛋白反應的操作過程如圖1所示[2]：第一步是蛋白質在蛋白酶作用下分解成低聚肽混合物；第二步是濃縮反應，通常用冷凍干燥或噴霧干燥將水解產物濃縮，同時除去一些非蛋白物質；第三步是合成反應，調整濃縮產物濃度或加入肽、氨基酸衍生物，加入蛋白酶，調整到合適的pH進行類蛋白反應[3]。

一些含蛋白質的農業和食品原料可以用作底物進行類蛋白反應，如植物葉子蛋白、玉米蛋白、卵白蛋白、牛奶、玉米、菌蛋白、魚和魚飼料等，但在肉和畜禽屠宰副產物中未見報道[4]。本文對類蛋白反應的機理、影響因素以及在肉類中的應用進行綜述，以期為蛋白質的深度利用以及高值化研究提供理論參考。

1 類蛋白反應機理

在一個多世紀的時間里，人們對類蛋白的了解有限，形成機理并未闡明。在19世紀80年代中期，高投入和低產量限制了類蛋白的商業化應用，人們對類蛋白營養方面的研究興趣有所下降，但是在近十年內，類蛋白再次出現在研究人員的視野。

類蛋白形成的機理還沒有完全被闡述清楚。當使用失活的蛋白酶時，基于游離氨基氮含量的降低和沉淀的生成，早年認為類蛋白反應是蛋白質的重新合成，然而，有研究認為沉淀是水解的產物中高分子量物質的變性形成的，在類蛋白反應中疏水相互作用在肽的聚集中起主要作用[5]，可是這些結論沒有排除縮合和轉肽作用的參與，后兩者會導致氨基酸殘基的重排，在疏水誘導的肽聚集前形成“疏水內核”。后來，研究人員又提出了幾個類蛋白形成的機理，包括肽的縮合，轉肽和由物理力形成的聚集作用。

1.1 縮合反應

縮合反應是指蛋白水解物中的肽和氨基酸在酶的催化作用下形成肽鍵。在縮合反應過程中，游離氨基酸含量下降，生成了新的高分子質量的蛋白質或肽。張娟娟等[6]以牡蠣為原料制備鋅離子結合類蛋白反應修飾肽，通過紅外光譜分析發現：反應后吸收峰變寬增強，指紋區吸收帶較多，生成了新的物質，證明發生了縮合反應；崔鐵軍[7]和任增超等[8]分別研究了魚類和羅非魚下腳料的類蛋白反應，發現反應后均生成了分子質量較大的類蛋白，證明小分子的多肽和氨基酸發生了縮合反應；YAMASHITA等[9]以大豆蛋白為原料，對其水解物進行類蛋白反應，得到蛋白水解物分子質量約為2.1 kDa，而肽分子質量約為21.6 kDa，表明有大分子物質生成。然而，已證明封閉肽的氨基和羧基末端只會稍微降低類蛋白的產量[10]。這表明，類蛋白反應可能還有除縮合作用外的其他機制。

1.2 轉肽作用

轉肽作用一般指轉肽基作用，涉及到肽鏈一級結構的改變，在這個過程中有肽鍵的斷裂和形成，使氨基酸殘基從一個肽序列轉移到另一個肽序列。LOZANO等[11]發現在類蛋白反應過程中，肽分子通過肽的作用，將疏水性氨基酸轉化為疏水性多肽，并逐漸形成不溶于水的類蛋白產物。綜上所述，類蛋白反應過程中縮合作用較小，主要是轉肽作用。

1.3 物理聚集作用

類蛋白的形成除了縮合反應和轉肽作用外，還可能與物理聚集有關，主要是氫鍵和疏水相互作用。蛋白質中存在疏水性氨基酸，疏水性相互作用越強，類蛋白質反應越好[4]。圖2描述了類蛋白形成過程中蛋白酶誘導聚合反應的過程。梁雪[12]分析了類蛋白產物的結構特征。發現類蛋白產物的二級結構與原蛋白相比發生了變化，表面疏水性增加，證明了反應過程中存在氫鍵和疏水相互作用。姜歲歲等[13]也同樣提出，類蛋白反應產物的穩定性主要依賴于疏水鍵和氫鍵。

圖2 類蛋白形成過程中蛋白質酶誘導聚集反應步驟[5]Fig.2 Steps of protein-enzyme induced aggregation in the process of plastein formation

總之，類蛋白反應的機制比較復雜，目前主要是縮合、轉肽、物理聚集作用。周雪松等[14]認為要判斷哪一種機制占主導作用主要看兩個方面，一是終產物平均分子質量和水解產物平均分子質量相比是否會因為類蛋白反應發生變化；二是可溶肽酶促轉化成不溶物質是否與分子質量的增加有關。也有研究認為哪種機制占主導與參加反應的底物、酶、溫度、pH等有關[15]。比如濃度對類蛋白反應影響非常大，反應過程中可能存在水解和縮合兩個過程，底物濃度較高時，縮合反應占主導；底物濃度較低時，水解反應占主導。

2 類蛋白反應影響因素

影響類蛋白反應的因素很多，如酶、底物、溫度和pH，每個因素的改變都能影響類蛋白產率。類蛋白反應一般在底物濃度30%～50%(質量濃度)，最好在40%，pH 3.0～7.0，溫度37～50 ℃時進行。根據孵育的條件，類蛋白反應的時間為24～72 h[16]。表1列舉了不同物質發生類蛋白反應的最優條件。

表1 不同物質發生類蛋白反應的最優條件Table 1 Optimal conditions for enzymatic hydrolysis of different substances

2.1 蛋白酶的影響

類蛋白反應需要有活性的酶參與[10]，酶活性越高，產物產量越高。水解和合成可以是不同的酶，也可以用一種酶，使用不同的酶會導致蛋白質進一步水解，使產量降低[5]。蛋白質水解及類蛋白反應中用到的酶包括木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶等，一般認為胃蛋白酶是高產率類蛋白反應的最有效的酶，尤其是近中性時凝膠強度最高。許永紅[24]提出當使用相同的底物時，蛋白酶不同會導致作用結果不同，蛋白質水解中多肽的長度及組成結構不同，因此蛋白酶的選擇至關重要。唐霄等[21]以鵝肉為原料，用4種酶制備呈味肽，發現在相同底物條件下使用不同的酶，在不同底物條件下使用相同的酶都會影響蛋白質的水解效果，同時對使用4種酶的滋味進行評定，發現使用中性蛋白酶制得的水解物風味較好。趙曉玥[25]為了提高海參腸、卵的綜合利用率，對酶解工藝進行優化，發現在木瓜蛋白酶添加量為3%，風味蛋白酶添加量2%的條件下水解度最高，達到64%，可以獲得口感、風味較好的酶解產物。這都體現了蛋白酶會影響類蛋白反應產物的產率和風味。

2.2 反應溫度的影響

類蛋白反應是酶促過程，因此反應溫度會影響類蛋白產率。一般來講，溫度升高會增加類蛋白產率。但是溫度過高(大于70 ℃)時使酶失活，類蛋白產率比20～50 ℃任何一個溫度都低。WILLIAMS等[4]在不同溫度下用胃蛋白酶孵育霉菌蛋白肽樣品，結果顯示，在研究的最高溫度(65 ℃)下，類蛋白迅速形成，產量為最大量的93%，在50 ℃和37 ℃下孵育，以百分比表示的類蛋白生成速率稍慢。SUKAN等[26]的研究結果顯示胃蛋白酶催化合成類蛋白反應的最適溫度在37～50 ℃，也證實了這一點。王俊霞等[27]通過熱反應制備雞肉香精，通過優化酶解參數發現當溫度過高(達到160～180 ℃)時，會產生一些小分子的醛酮醇類物質，對雞肉香精的風味產生不好的影響。

2.3 反應體系的pH值

pH也會影響合成蛋白的產量。因大多數蛋白質的等電點都在pH=4.0～7.0[10,26]，所以這也是類蛋白反應的最適pH。任增超等[8]測試在相同的水解度、底物濃度和加酶量的條件下，使用不同的pH對合成蛋白產量的影響，發現pH在2～5時，類蛋白產率呈上升趨勢，在pH=5時達到最高，產量不再增加。YAMASHITA[9]提出，用于水解和合成反應的最適pH值不一定一致，定義合成中的最佳pH減去水解中的最佳pH為ΔpH，并將與ΔpH有關的情況分為3種：ΔpH>0、ΔpH<0和ΔpH=0，分別代表了合成最適pH大于、小于和等于水解最適pH的情況，分別對應3種酶：胃蛋白酶型、胰凝乳蛋白酶型和木瓜蛋白酶型。通常，胰凝乳蛋白酶類型的酶的pH差異要比其他酶大，在任何pH范圍內均不能催化生成類蛋白產品。

2.4 底物的影響

2.4.1 底物濃度

濃度是影響類蛋白反應的主要因素之一。有文獻認為最適肽濃度為20%～40%，在高于或低于此濃度時類蛋白的產率與肽濃度形狀上幾乎呈指數關系[4]。TSAI等[28]在不同底物濃度的條件下對合成類蛋白反應進行研究，發現底物肽的濃度在11%～43%，隨著底物濃度增加，類蛋白的產量呈指數增長，且底物濃度為30%～40%時，合成類蛋白產率最大。楊倩等[29]觀察了不同濃度下3種酶對大米蛋白的水解效果，發現隨著底物濃度的增加，大米蛋白的水解度均呈現先增加后減少的趨勢，并且胰蛋白酶、堿性蛋白酶和胃蛋白酶底物濃度分別在7%、5%和5%時，大米蛋白酶解產物的水解度最高，相比之下，底物濃度對對堿性蛋白酶水解效率的影響更顯著。因此，選擇合適的底物濃度對于類蛋白的合成至關重要，底物濃度過高或過低都會影響合成類蛋白產量，甚至不合成類蛋白。

2.4.2 底物的相對分子質量

除了底物濃度，底物的相對分子質量也會影響合成蛋白的產量。張雅麗等[20]取水解度不同的大豆蛋白胰蛋白酶水解物，發現在水解度為80%和70%時，合成類蛋白產量最高，分別為70%和52%；水解度為40%和50%時，未發生類蛋白反應，甚至有微弱水解，水解度增大，合成類蛋白產物增加，但當水解度增加到90%時，合成類蛋白產物降低。由此可見，底物水解度(即分子質量大小)是影響合成類蛋白產物的重要因素。

2.4.3 底物的親/疏水性

底物的親/疏水性對類蛋白反應有很大的影響。蘇亞文等[30]提出類蛋白在水中的溶解度很低，一般疏水性肽會優先參與反應，疏水性越高，反應速度越快，但是疏水性過高的底物還沒進行類蛋白反應就從溶液中沉淀出來，產量很低；親水的水解物也不是進行類蛋白反應的有效底物，因為生成的類蛋白產物會溶于水。

3 類蛋白反應在肉類中的應用

3.1 提高肽的生物活性

3.1.1 修飾酶解液活性

蛋白酶和類蛋白反應與外源氨基酸的結合可以產生具有增強生物活性和潛在健康效益的酪蛋白水解產物[31]。目前多數研究是利用類蛋白反應修飾改善酶解液活性。例如，沈晴晴等[32]以海地瓜為原料，經過類蛋白反應后，得到的蛋白酶解物具有血管緊張素轉換酶(angiotensin-converting enzyme，ACE)抑制活性，且活性高于原酶解液，同時發現類蛋白反應修飾使海地瓜天然肽序列發生改變，得到了新的具有較高ACE抑制活性的氨基酸序列NQNFVQYTTNT。張娟娟等[6]以牡蠣為原料，采用鋅離子結合谷氨酸和類蛋白反應對多肽進行修飾。結果表明，鋅離子結合物具有一定的穩定性和抗消化能力，但蛋白結合肽的穩定性和抗消化能力較高。GAO等[33]用蛋白酶催化類蛋白反應，提高了ACE抑制能力。其中胰酶催化的類蛋白反應對ACE的抑制活性最高，提高了28.57%，表明雞血漿蛋白是具有開發潛力的新功能食品。馬春敏等[34]在茶腸切片上涂抹一定濃度的色氨酸及類蛋白反應修飾產物，發現具有一定的抑菌作用，能夠得到延長茶腸的保質期。

3.1.2 提高呈味肽活性，改善風味

呈味肽屬于生物活性肽，可以由氨基酸合成，從食物中提取，也可以通過酶解打開蛋白質的結構獲得，有酸、甜、苦、鮮和咸5種不同的呈味效果，可以使食品風味增強，柔和細膩，達到使用單一調味品不能達到的效果。國內一些食品加工企業和調味料生產企業大多使用這種方式來提高產品的檔次。

姜淼等[35]對海參腸進行酶解和Plastein反應修飾，得出在一定條件下風味蛋白酶酶解產物鮮味濃郁。游離氨基酸組成分析顯示，經過Plastein反應后，必需氨基酸含量增加，脫腥后的修飾物有一定的海鮮風味。從大部分研究結果可以看出：蛋白酶酶解和類蛋白反應修飾可以提高呈味肽活性，生產出更多美味的食物。

3.1.3 提高抗氧化肽活性

蛋白質的酶水解還可以制備具有抗氧化活性的產物抗氧化肽。王晗欣等[36]用堿性蛋白酶水解鷹嘴豆蛋白，并對水解物進行類蛋白反應修飾，發現修飾后產物的還原力和羥自由基清除力明顯提高。吳丹等[37]用木瓜蛋白酶水解酪蛋白，用響應面優化法得出類蛋白反應的最適條件為：溫度30 ℃，反應時間5.6 h，酶添加量500 U/g，底物質量分數50%。通過這兩步得到抗氧化肽，通過對清除DPPH自由基活性、清除羥自由基活性、清除ABTS自由基活性的測定得出結論：類蛋白反應可以提高產物的抗氧化活性。戚莉佳等[38]以酪蛋白水解產物為原料，通過測定DPPH自由基清除能力、超氧陰離子清除能力和還原能力，獲得類蛋白反應改性產物的抗氧化活性。結果表明，色氨酸改性產物具有較高的抗氧化活性。本研究提供了一種獲得高純度抗氧化肽的方法。

類蛋白反應在生物活性肽領域具有新的應用價值，利用食品蛋白質酶解產物得到活性肽，可以提高食物的抗氧化性，提高食品風味，生產出促進健康的功能性食品配料，具有其他處理方式沒有的優越性，但是因為場地、成本等的約束性，類蛋白反應距離在肉類工業中大范圍應用還有一定距離。

3.2 減少蛋白酶解液苦味

蛋白酶水解的蛋白質可提供高附加值的產品，加工后的產品可獲得營養和功能。因此，蛋白酶水解技術在動物制品和海產品中得到了廣泛的應用。但是蛋白酶解液在產品開發和工業化生產仍然存在許多問題，具有苦味是蛋白酶解風味不佳的主要原因。蛋白酶分為內切酶和外切酶兩種，內切蛋白酶疏水氨基酸含量多，酶解液較苦；外切蛋白酶是從肽鏈的一端將氨基酸切下來，疏水氨基酸少，酶解液苦味較弱。蛋白水解物中的疏水性氨基酸殘基可以在類蛋白反應中被包埋聚集構成“疏水核”，從而減少蛋白質水解物的苦味，并且在整個過程中保持了肽的完整性和水解產物的功能性，不會影響蛋白質的結構和功能。

陳海濤等[39]以雞肉酶解液為原料，考察不同的酶解條件對雞肉香精香氣的影響，得出在酶解溫度50 ℃、底物質量比1∶1、總加酶量1.1%、加酶方式 1 h∶2 h的條件下，水解度可達20.47%，制備的雞肉香精肉香突出，仿真度高，且將酶解時間定在3 h可減少美拉德反應產生一些短肽類的苦味物質，為具有雞肉香氣特征的熱反應香精的生產提供參考。王朋[40]以金槍魚下腳料為實驗材料，利用干燥的肽粉進行類蛋白反應，針對目前蛋白水解物中普遍存在的腥苦味進行了相關研究。用噴霧干燥和冷凍干燥的方法對目標組分干燥，測定干燥過的活性肽粉的活性效果。確定各因素對類蛋白反應的影響，得出使苦味得到改善的條件是pH為5，底物濃度40%，溫度32 ℃。通過對腥味進行評分，得出腥味物質主要是氮氧類化合物。通過這些實驗，使類蛋白反應產物最終達到脫苦脫腥，改善風味的效果。

3.3 改善蛋白的功能特性

蛋白質的功能特性包括溶解性、乳化性、起泡性和穩定性等。類蛋白反應可以改善蛋白的某些加工特性。周雪松等[14]提出，通過類蛋白反應生成的物質能改變氨基酸的組成，可以彌補原來的氨基酸組成不均衡的缺陷，有利于開發更多的優質蛋白質，同時合成類蛋白后溶液溶解度增加，這在研制一些飲料等方面具有良好的前景。鄭玥[41]等用胃蛋白酶水解醋蛋液并用類蛋白反應修飾，發現水解物的膽酸結合能力和對蛋白酶抵抗的能力提高。王再揚等[42]以牡蠣源多肽為基礎，研究了結合物的生物補鋅性。發現結合物進入腸道后減少了食物組分對于鋅的競爭型組合，類蛋白反應將與鋅結合能力強的氨基酸引入到牡蠣肽中，促進了機體對于鋅的吸收，進一步提高了與鋅的結合能力和穩定性。由此可見，類蛋白反映在改善蛋白的功能特性等方面具有很好的應用價值。SIKORSKI等[43]提出類蛋白反應將魚濃縮蛋白轉換為具有穩定理想感官特性的產品，可以用來代替肉類。YAMASHIFA等[44]提出了類蛋白反應可以提高大豆蛋白含硫氨基酸水平，將此用于小鼠進行動物試驗，與未進行類蛋白反應的小鼠進行比較，發現營養價值明顯提高。RAGHOUNATH等[45]嘗試對魚類廢棄物水解液中進行硅化，將其置于類蛋白反應中，用來回收蛋白質，達到了理想的效果。這表明類蛋白反應具有從非常規資源回收蛋白質的潛力。

類蛋白反應可以改善氨基酸組成，解決氨基酸組成不均勻的問題，同時經過反應合成類似蛋白質的物質，有利于開發新的蛋白質資源，提高蛋白質的營養價值，為生產出更優質的蛋白質提供了基礎。日常生活中可以利用類蛋白反應提高溶解度的特性生產飲料，利用其補鋅性用于鋅缺乏癥，為我們的生產生活帶來了便利。

4 結論與展望

隨著酶技術和生物技術的快速發展，國內外學者對類蛋白反應的機制和應用研究越來越深入，目前類蛋白反應已經被廣泛應用于肉類中，具有巨大的發展潛力和市場需求。但大部分研究仍處于基礎階段，大都是通過優化酶解工藝得到能改變蛋白特性的最佳酶解條件，要想在肉類中實現工業化，還需要更大規模和更深入的研究。

我國人口資源眾多，優質蛋白資源短缺，隨著人們生活水平的提高，越來越多的人致力于追求綠色健康的食品。肽產品比蛋白質更容易被人體消化和吸收，進一步加強對類蛋白反應機制研究，將重心放在提高工藝條件的可控性和產品的穩定性，設計更加高效的酶及控制成本上，開發利用合適的酶制劑和氨基酸衍生物，對促進類蛋白反應在肉類工業中的應用有重要意義。