N-酰基高絲氨酸內酯酶的生物信息學分析

楊艷北 許晶 沈城輝 許繼國 饒友生

摘要：采用生物信息學分析方法，對沼澤紅假單胞菌N-酰基高絲氨酸內酯酶理化性質和結構特征進行預測。結果表明，該蛋白為穩定的親水性蛋白，定位在細菌的細胞質中，無信號肽結構。二級結構中含有α-螺旋、β-轉角、延伸鏈和無規則卷曲等結構元件，α-螺旋和無規則卷曲對三級結構的穩定和功能發揮具有重要意義。含有6個磷酸化位點，無跨膜結構域。參與細菌群體感應淬滅。

關鍵詞：沼澤紅假單胞菌;N-酰基高絲氨酸內酯酶;生物信息學

中圖分類號：Q939.96? ? ?文獻標志碼：A? ? ?文章編號：1001-1463（2021）02-0031-07

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2021.02.008

Bioinformatics Analysis of N-acyl Homoserine Lactonase

YANG Yanbei 1，2， XU Jing 3， SHEN Chenghui 3， XU Jiguo 1，2， RAO Yousheng 1，2

（1. Institute of Biotechnology Research， Nanchang Normal University， Nanchang Jiangxi 330000， China;? ? ? ? 2. Province Key Lab of Genetic Improvement of Indigenous Chicken Breeds， Nanchang Jiangxi 330000， China;3. Department of Biology， Nanchang Normal University， Nanchang Jiangxi 330000， China）

Abstract：The aim of the present study was to understand the physical and chemical properties and structural characteristic of N-acyl homoserine lactonase in Rhodopseudomonas palustris by bioinformatics method. The results showed that the protein was a stable hydrophilic protein. The protein was localized in the cytoplasm of bacteria. The protein had no signal peptide structure. The secondary structure of the protein contained α-helix， β - angle， extended chain and random coil. The α-helix and random coil played an important role in the stability and function of tertiary structure. The protein contained six phosphorylation sites. The protein had no transmembrane domain. The protein was involved in quorum sensing quenching.

Key words：Rhodopseudomonas palustris;N-acyl homoserine lactonase;Bioinformatics;Biofilm;Analysis

沼澤紅假單胞菌可作為微生物飼料添加劑，屬于益生菌，廣泛地應用于水產養殖 業[1 - 2 ]。生物被膜能夠增強益生菌對溫度、胃酸和機械剪切力的抵抗能力。生物被膜包埋到微膠囊中創造了新一代的益生菌，國內外學者稱之為“第四代益生菌”。微膠囊技術和生物被膜的結合，進一步提高了益生菌對于惡劣環境的抵抗能力。“第四代益生菌”具有更好的抗冷凍干燥能力和耐熱性，對于低溫儲藏和胃液處理，存活率更高[3 ]。群體感應是細菌通過分泌信號分子來調控其不同生物學功能的一種群體行為，例如細菌生物被膜的形成[4 ]。革蘭氏陰性細菌群體感應系統主要由N-酰基高絲氨酸內酯類信號分子介導，信號分子的濃度隨細菌密度的增加而增加，當達到或超過閾值時，信號分子同受體結合從而觸發信號轉導，導致細菌生物被膜的形成[5 ]。N-酰基高絲氨酸內酯類信號分子對革蘭氏陰性細菌群體感應系統的調控具有十分重要的作用，通過破壞或干擾N-酰基高絲氨酸內酯的合成，達到淬滅群體感應系統的目標。群體感應淬滅通過抑制信號分子的合成，降低信號分子的濃度，降解或修飾信號分子結構，從而破壞細菌群體感應系統的功能。N-酰基高絲氨酸內酯酶作為廣泛存在的群體感應淬滅酶，表現出了極強的淬滅活性[6 - 7 ] 。我們選取N-酰基高絲氨酸內酯酶，采用生物信息學的分析方法，對其理化性質、親水性/疏水性、亞細胞定位、信號肽、二級結構、三級結構、磷酸化位點、跨膜結構域和功能結構域進行分析和預測，旨在為后續研究沼澤紅假單胞菌生物被膜形成機制奠定基礎，也為生物被膜增強劑的開發提供參考。

1? ?材料與方法

1.1? ?數據來源

沼澤紅假單胞菌N-酰基高絲氨酸內酯酶蛋白質序列來自美國國家生物信息中心（NCBI）中已登錄的序列，蛋白質序列編碼為WP_119858436.1[N-acyl homoserine lactonase family protein （Rhodopseudomonas palustris）]。

1.2? ?研究方法

在線生物信息學預測工具分析N-酰基高絲氨酸內酯酶的蛋白質序列：利用ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）分析理化性質，利用ProtScale （https：//web.expasy.org/protscale/）進行親水性、疏水性的分析和預測，利用PSORTb version 3.0.2 （https：//www.psort.org/psortb/）和LocTree3 （https：// www.rostlab.org/services/loctree3/）進行細菌亞細胞定位分析和預測，利用SignalP 4.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/）進行信號肽分析和預測，利用SOPMA（https：

//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？ page=/NPSA/npsa_sopma.html）進行蛋白質二級結構分析和預測，利用SWISS-MODEL （https： //swissmodel. expasy. org/）進行蛋白質三級結構分析和預測，利用NetPhosBac 1.0 server（https：//services.healthtech.dtu.dk/service. php？NetPhosBac-1.0）進行細菌蛋白質的磷酸化位點分析和預測。利用TMHMM 2.0 server（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？TMHMM-2.0）進行跨膜結構域的分析和預測，利用NCBI的保守域數據庫（CDD）（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）進行功能結構域分析和預測。

2? ?結果與分析

2.1? ?N-酰基高絲氨酸內酯酶理化性質分析

利用ProtParam分析了N-酰基高絲氨酸內酯酶的理化性質。N-酰基高絲氨酸內酯酶的分子量為31 488.50 Da，理論等電點為5.14。氨基酸數量為284個，其中含量較多的是甘氨酸（28個，9.9%）、丙氨酸（27，9.5%）、天冬氨酸（24個，8.5%）、亮氨酸（24個，8.5%）。N-酰基高絲氨酸內酯酶含有3個半胱氨酸，推測N-酰基高絲氨酸內酯酶可能具有二硫鍵結構。N-酰基高絲氨酸內酯酶不具有吡咯賴氨酸和硒半胱氨酸等稀有氨基酸。N-酰基高絲氨酸內酯酶的氨基酸組成分別為丙氨酸（27個，9.5%）、精氨酸（19個，6.7%）、天冬酰胺（7個，2.5%）、天冬氨酸（24個，8.5%）、半胱氨酸（3個，1.1%）、谷氨酰胺（9個，3.2%）、谷氨酸（13個，4.6%）、甘氨酸（28個，9.9%）、組氨酸（8個，2.8%）、異亮氨酸（15個，5.3%）、亮氨酸（24個，8.5%）、賴氨酸（7個，2.5%）、蛋氨酸（8個，2.8%）、苯丙氨酸（15個，5.3%）、脯氨酸（12個，4.2%）、絲氨酸（17個，6.0%）、蘇氨酸（15個，5.3%）、色氨酸（7個，2.5%）、酪氨酸（9個，3.2%）、纈氨酸（17個，6.0%）。N-酰基高絲氨酸內酯酶帶負電荷氨基酸殘基數（天冬酰胺+谷氨酸）為37個，帶正電荷氨基酸殘基數（精氨酸+賴氨酸）為26個，其分子式為C1407H2143N387O416S11，原子總數為4 364。假設N-酰基高絲氨酸內酯酶所有的胱氨酸殘基以半胱氨酸的形式出現，即形成二硫鍵，N-酰基高絲氨酸內酯酶的消光系數為52 035 L/（mol·cm），吸光度（A280）為1.653;假設二硫鍵全部打開，N-酰基高絲氨酸內酯酶的消光系數為51 910 L/（mol·cm），吸光度（A280）為1.649。當N-酰基高絲氨酸內酯酶的N端為甲硫氨酸時，在哺乳動物網織紅細胞中的半衰期為30 h，在酵母體內的半衰期大于20 h，在大腸桿菌體內半衰期大于10 h。N-酰基高絲氨酸內酯酶的不穩定系數為24.62，小于閾值40，在溶液中性質穩定，推測N-酰基高絲氨酸內酯酶為穩定蛋白。N-酰基高絲氨酸內酯酶脂肪指數為80.42，親水性平均值為-0.187。親水性平均值為負值，推測N-酰基高絲氨酸內酯酶為親水性蛋白。

2.2? ?N-酰基高絲氨酸內酯酶親水性/疏水性分析

利用ProtScale分析了N-酰基高絲氨酸內酯酶的親水性/疏水性。通過圖1可以看出，在N-酰基高絲氨酸內酯酶多肽鏈中，第119位谷氨酸有最低分值-2.689，親水性最強;第38位異亮氨酸有最高分值2.267，疏水性最強。親水性氨基酸數量較多，親水性平均值為-0.187，推測N-酰基高絲氨酸內酯酶表現為親水性。

2.3? ?N-酰基高絲氨酸內酯酶亞細胞定位分析

PSORTb version3.0.2是目前最精確的細菌定位預測工具之一，利用PSORTb version 3.0.2分析了N-酰基高絲氨酸內酯酶的亞細胞定位。N-酰基高絲氨酸內酯酶的亞細胞定位分數分別為細胞質8.96，細胞質膜0.51，周質0.26，外膜0.01，細胞外0.26。定位分數顯示N-酰基高絲氨酸內酯酶定位在細菌的細胞質中。利用Loc Tree3分析了N-酰基高絲氨酸內酯酶的亞細胞定位，結果如圖2所示：N-酰基高絲氨酸內酯酶定位在細胞質中，亞細胞定位分數為100，精確度99%。基于上述2種在線工具的亞細胞定位預測表明，N-酰基高絲氨酸內酯酶定位在細胞質中。

2.4? ?N-酰基高絲氨酸內酯酶信號肽分析

利用SignalP 4.1 Server分析了N-酰基高絲氨酸內酯酶的信號肽，結果如圖3所示：原始剪切位點C最大值在第48個氨基酸，分值為0.132;綜合剪切位點Y最大值在第48個氨基酸，分值是0.137;信號肽S最大值在第27個氨基酸，分值為0.262;平均信號肽S值為第1～47個氨基酸，平均值是0.134;D值為第1～47個氨基酸，平均值是0.136;臨界值是0.570。D值是信號肽S最大值和綜合剪切位點Y最大值的平均值，對區分是否為分泌蛋白具有至關重要的作用。D值小于臨界值，未發現信號肽序列，故推斷N-酰基高絲氨酸內酯酶為非分泌性蛋白。

2.5? ?N-酰基高絲氨酸內酯酶二級結構分析

利用SOPMA分析了N-酰基高絲氨酸內酯酶的二級結構，結果如圖4所示：N-酰基高絲氨酸內酯酶可能包含的二級結構分別為α-螺旋（藍色）67個，占23.59%;β-轉角（綠色）28個，占9.86%;延伸鏈（紅色）64個，占22.54%;無規則卷曲（紫色）125個，占44.01%。可見無規則卷曲是N-酰基高絲氨酸內酯酶二級結構中最大量的結構元件。

2.6? ?N-酰基高絲氨酸內酯酶三級結構分析

利用SWISS-MODEL分析了N-酰基高絲氨酸內酯酶三級結構，得到以PDB ID： 3aj3.1.A（4-吡哆醇內酯酶）為模板的預測模型，作為本研究的N-酰基高絲氨酸內酯酶預測模型。從圖5看出，N-酰基高絲氨酸內酯酶預測模型與模板序列相似度為23.87%。N-酰基高絲氨酸內酯酶預測模型的全局模型質量評估分數（GMQE）為0.55，接近1。GMQE是一種質量評估方法，生成的GMQE在0到1之間，數字越高表明可靠性越高。通過SWISS-MODEL預測得出，N-酰基高絲氨酸內酯酶的三級結構（圖6），可見其α-螺旋和無規則卷曲結構豐富，數量較多，推測α-螺旋和無規則卷曲對N-酰基高絲氨酸內酯酶生物學功能的發揮具有重要作用。

2.7? ?N-酰基高絲氨酸內酯酶磷酸化位點分析

利用NetPhosBac 1.0 server分析了N-酰基高絲氨酸內酯酶的磷酸化位點。從圖7可以看出，磷酸化位點有6個，其中絲氨酸磷酸化位點包括73 S（殘基得分0.621）、183 S（殘基得分0.581）、194 S（殘基得分0.525）、278 S（殘基得分0.501），蘇氨酸磷酸化位點包括24 T（殘基得分0.510）、174 T（殘基得分0.508）。殘基得分介于0和1，當得分高于0.5時，殘基被預測為磷酸化位點。

2.8? ?N-酰基高絲氨酸內酯酶跨膜結構域分析

利用TMHMM 2.0 server分析了N-酰基高絲氨酸內酯酶的跨膜結構域，結果如圖8所示。預測N-酰基高絲氨酸內酯酶位于膜外的概率接近100%，位于膜內和跨膜區域的概率幾乎為0。因N-酰基高絲氨酸內酯酶無跨膜結構域，所以圖8中不顯示相應標記。推測N-酰基高絲氨酸內酯酶不屬于跨膜蛋白。

2.9? ?N-酰基高絲氨酸內酯酶功能結構域分析

利用NCBI的保守域數據庫（CDD）進行功能結構域分析，N-酰基高絲氨酸內酯酶參與細菌群體感應淬滅。從圖9可看出，N-酰基高絲氨酸內酯酶在31-251位氨基酸處含有保守結構域AHL_lactonase_MBL-fold，該結構域屬于MBL折疊金屬水解酶超家族，該家族主要由具有多種生物學功能的水解酶組成。N-酰基高絲氨酸內酯是許多革蘭氏陰性細菌群體感應系統中負責協調基因表達的信號分子。N-酰基高絲氨酸內酯酶具有群體感應淬滅功能，催化N-酰基高絲氨酸內酯的高絲氨酸內酯環的水解和開環，從而阻斷群體感應系統功能的發揮。

3? 小結與討論

益生菌是指當以足夠數量存在時可對機體健康產生有益作用的活的微生物[8 ]。沼澤紅假單胞菌屬于益生菌的一種，可作為微生物飼料添加劑使用，具有極高的應用價? ? ?值[9 ]。微生物飼料添加劑在高溫、胃酸、膽鹽等條件下易失活[10 ]，生物被膜狀態下的益生菌能夠很好地解決上述諸多問題[11 - 12 ]。與常規益生菌制劑相比，在高密度生物被膜狀態下益生菌制備的制劑具有更好的耐熱性、耐酸性和抗冷凍干燥能力[13 ]。我們利用NCBI的保守域數據庫進行功能結構域分析，結果顯示N-酰基高絲氨酸內酯酶參與細菌群體感應淬滅。群體感應是微生物之間通過信號分子進行交流的一種通訊機制，可使細菌表現出不同的生理行為，例如生物被膜的形成與生長[14 - 16 ]。細菌群體感應淬滅具有3種途徑，一是阻礙信號分子合成蛋白的產生，從源頭上使信號分子無法生成;二是通過降解信號分子，使信號分子濃度處于閾值以下，阻止下游基因的表達;三是阻止信號分子與相應受體蛋白的結合，使其無法行使轉錄調節因子的功能[6，17 - 18 ]。群體感應淬滅酶是最主要的群體感應淬滅手段之一，通過降解信號分子以及阻斷信號的產生和識別起到淬滅的作用。N-酰基高絲氨酸內酯都有一個高絲氨酸內酯環和酰胺鍵，可為群體感應淬滅酶提供相應的酶切位點。根據酶切位點的不同，群體感應淬滅酶包括內酯酶、酰胺酶和氧化還原酶三大類，其中N-酰基高絲氨酸內酯酶表現出了極強的淬滅活性。N-酰基高絲氨酸內酯酶是群體感應淬滅酶中首個被確定的群體感應淬滅酶[6，19 ]。N-酰基高絲氨酸內酯酶能夠水解N-酰基高絲氨酸內酯的內酯環，產生N-酰基高絲氨酸。在酸性條件下，N-酰基高絲氨酸能夠重新環化成N-酰基高絲氨酸內酯，因此N-酰基高絲氨酸內酯酶的淬滅作用是可逆的。N-酰基高絲氨酸內酯酶可分為不同的蛋白家族，不同的蛋白家族又包含多種具有同源性的酶[20 ]，本研究中的N-酰基高絲氨酸內酯酶屬于金屬水解酶超家族，具有水解酶活性，能夠催化N-酰基高絲氨酸內酯的高絲氨酸內酯環的水解和開環。N-酰基高絲氨酸內酯酶通過降解革蘭氏陰性細菌群體感應系統信號分子，從而調控細菌生物被膜的形成。N-酰基高絲氨酸內酯酶作為生物被膜形成過程中的關鍵調控蛋白，是理想的生物被膜增強劑的候選蛋白，因此，通過不斷的對其進行深入研究和分析，對生物被膜的人為控制將具有非常誘人的前景。

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（本文責編：陳? ? 偉）