貓爪草多糖抗炎作用機制的實驗研究

朱輝

摘?要：目的：考察不同濃度貓爪草多糖（PRRT）對早、中、晚期炎癥模型的影響，探索其抗炎機制方法：將小鼠和大鼠隨機各分為陰性對照組和陽性對照組和PRRT低、中、高劑量組，每組10只。采用二甲苯致耳廓腫脹、醋酸誘發小鼠腹腔毛細血管通透性增高，蛋清致大鼠背部氣囊滑膜炎、棉球誘發小鼠肉芽腫，探討PRRT的抗炎作用。稱體質量測定各組小鼠耳的炎癥腫脹程度及肉芽增生水平，用化學方法檢測各組小鼠腹腔洗滌液中的伊文思藍含量、滑膜炎滲出液容積、滲出液中的白細胞（WBC）計數和腫瘤壞死因子（TNF）a含量，滲出液和血清中超氧化物歧化酶（S0D）、丙二醛（MDA）含量。結果：PRRT組分的高劑量組與陰性對照組相比，可顯著抑制小鼠耳腫脹、降低毛細血管通透性及肉芽組織增生。結論：PRRT能夠緩解早、中、晚期炎癥形成，其抗炎機制可能是PRRT可降低血清和滑膜炎滲出液中的MDA含量，提高SOD活性，進而減輕脂質過氧化損傷。

關鍵詞：貓爪草多糖（PRRT）;腫瘤壞死因子（TNF）a含量;炎癥;超氧化物歧化酶;丙二醛（MDA）;白細胞計數;小鼠

Abstract：Objective：To?observe?the?effects?of?different?concentrations?of?Polysaccharide?of?Radix?Ranunculi?Ternati（PRRT）on?inflammatory?models?in?different?stages?and?to?explore?its?possible?mechanism.Methods：Mice?and?rats?were?randomly?divided?into?negative?control?group，positive?control?group?and?PRRT?low，medium?and?high?dose?groups，with?10?rats?in?each?group.Ear?swelling?induced?by?xylene?and?abdominal?cavity?induced?by?acetic?acid?were?usedCapillary?permeability?increased，egg?white?induced?back?balloon?synovitis?in?rats，cotton?ball?induced?granuloma?in?mice，Antiinflammatory?effect?of?PRRT.The?body?weight?was?measured?to?determine?the?inflammatory?swelling?degree?and?granulation?proliferation?level?of?mice?ears?in?each?group.The?Evans?blue?content，synovitis?exudate?volume，white?blood?cell（WBC）count?and?tumor?necrosis?factor（TNF）a?content?in?peritoneal?washing?liquid，and?superoxide?in?exudate?and?serum?of?mice?in?each?group?were?detected?by?chemical?methods.Contents?of?superoxide?dismutase（SOD）and?malondialdehyde（MDA）.Results：Compared?with?the?negative?control?group，the?highdose?PRRT?group?significantly?inhibited?ear?swelling，decreased?capillary?permeability?and?granulation?tissue?proliferation?in?mice.Conclusion：PRRT?can?The?mechanism?may?be?that?PRRT?can?reduce?MDA?in?serum?and?synovitis?exudate?to?reduce?inflammation?formation?in?various?stages.Content，improve?SOD?activity，and?then?reduce?lipid?peroxidation?damage.

Keywords：Polysaccharide?of?Radix?Ranunculi?Ternati（PRRT）;tumor?necrosis;factoralpha;inflammatory;superoxide?dismutase;malondialdehyde;white?blood?cell?count;animal?mice

1?緒論

貓爪草（Radix?Ranunculi?Ternati）為毛莨科植物小毛莨（Ranunculus?Ternatus?Thunb）的塊根，1977年開始收載于《中華人民共和國藥典》。貓爪草甘、辛、溫，入肝、肺經，具有清熱解毒、散結消腫之功效，現安徽、河南、江西、浙江、四川、云南等地均有大量分布[13]。但由于宣傳力度不夠，很多專業人員及一些專家學者對貓爪草不甚了解，導致貓爪草開發利用不夠。貓爪草的現代實驗研究起步很晚，目前少有的研究表明其具有如下作用：抗腫瘤[4]、抗菌作用[1]、調免疫[6]、抗氧化[7]。此外，貓爪草所含的黃酮苷對動物有鎮咳、祛痰消炎作用;對中樞神經、心臟、呼吸系統具有不同程度的抑制作用。

據報道，貓爪草的主要化學成分包括甾醇、內酯、不飽和脂肪酸、多糖、微量元素等，而活性部位篩選試驗表明多糖是其最重要活性成分之一。多糖是廣泛存在于動物、植物和微生物細胞壁中的一種高分子聚合物，是構成生命的四大基本物質之一。多糖的藥用研究始于40年代，起初可作為廣泛的免疫促進劑。經過半個多世界的發展，多糖的研究取得了重大進展。建立了多糖的提取純化、生物活性測定和結構分析等一系列方法，研究的廣度和深度不斷加深。大量研究證實多糖具有多種活性：（1）多糖可通過激活T淋巴細胞和B淋巴細胞來增強機體免疫力，如香菇多糖能促進特異性細胞毒T細胞的產生并提高其殺傷活力而提高機體免疫力;（2）多糖能通過激活巨噬細胞來提高抗腫瘤和抗病毒的能力，如人參多糖及靈芝多糖均可增加小鼠體內巨噬細胞的數量;（3）多糖可通過激活網狀內皮系統來增強機體消滅病原體、排除異物和吞噬老化細胞的作用，如三七多糖、杜仲多糖及甘草多糖都能顯著增強網狀內皮系統的活性。此外，許多中藥及植物的多糖也表現出顯著的抗炎活性[812]。

炎癥（Inflammation）是機體對于刺激的一種防御反應，主要表現為紅、腫、熱、痛和功能障礙。全球約有數以億計的人遭受著炎癥的折磨，是全球性的無法治愈的病癥之一[13]。炎癥的病理變化目前尚不完全清楚，一般按病理過程可將其發展過程分為三個階段。早期出現毛細血管擴張、通透性增加;中期表現為血小板吸附及白細胞游走;晚期則出現肉芽組織增生[14]。炎性介質是參與炎癥反應的化學活性物質，包括趨化因子和細胞因子，均可與炎性細胞相互作用而產生炎癥反應。腫瘤壞死因子（TNFα）、氧自由基等也在炎癥反應中發揮主要作用，目前對炎癥的治療主要包括非甾體類抗炎藥和腎上腺皮質激素類，但存在諸多毒副作用，患者依從性小。因此，開發新型抗炎藥物已成為當務之急。而多糖優異的抗炎作用已引起了人們的關注。本文考察了貓爪草多糖（PRRT）其對早、中、晚期炎癥的影響，探討了其可能的抗炎作用機制，以期為多糖抗炎藥物的開發提供參考和支持。

1.1?實驗材料

1.1.1?藥品

1.1.2?動物

1.1.3?主要試劑

1.1.4?儀器

2?材料和方法

2.1?實驗方法

（1）小鼠耳廓腫脹實驗。采用小鼠甲苯致炎法[15]，選取體重（20±2g）雌性健康小鼠50只，隨機分為5組，即PRRT低（400mg/kg）、中（800mg/kg）、高劑量（1600mg/kg）組，陽性對照組和陰性對照組，每組10只。給藥組分別給予PRRT相應劑量，陽性對照組給予阿司匹林，陰性對照組給予等體積蒸餾水，每日一次，連續5日。末次給藥1h后將0.03mL二甲苯涂抹于小鼠右耳。2h后處死，取下兩耳并在相同部位用打孔器打孔，稱重。兩耳只差為腫脹度，腫脹抑制率（%）=（對照腫脹度給藥腫脹度）/對照腫脹度。

（2）小鼠棉球肉芽腫實驗。參考文獻，用棉球制作小鼠肉芽腫[17]，小鼠于經乙醚淺麻醉后，將重量為5mg的滅菌棉球植入小鼠左右腹股溝兩側皮下，縫合傷口。經4h后給藥。每日一次，連續7日，給藥量同實驗1。末次給藥后于次日處死小鼠，取出棉球肉芽組織，經80℃烘干2h，稱重。肉芽組織的重量=取出的棉球肉芽組織重量棉球原重量，腫脹抑制率（%）=（對照肉芽組織重量-給藥肉芽組織重量）/對照肉芽組織重量。

（3）小鼠腹腔毛細血管通透性實驗。采用醋酸致炎法[16]，實驗用小鼠分組、給藥方法同實驗1.2.1，連續5日，末次給藥1h后，分別將0.5%伊文斯蘭生理鹽水0.1mL/10g靜脈注射與各鼠尾，再于腹腔注射0.6%冰醋酸溶液0.1mL/10g。20min后處死小鼠，腹腔注射6mL生理鹽水。將腹部剪開，吸出洗滌液，加入10mL生理鹽水，離心（3000rpm，15min），取上清液，于590nm波長測定吸光度。

（4）大鼠氣囊滑膜炎實驗。參考文獻后采用蛋清制作大鼠背部氣囊滑膜炎。選取體重（250±10g）雌性健康小鼠50只，分組同實驗1.2.1。第1日將無菌空氣20mL注射于大鼠背部皮下，形成氣囊;第3日在原氣囊處注射無菌空氣20mL，同時在首次注入空氣當日開始灌胃給藥，連續7日，劑量同1.2.1，末次給藥后于大鼠背部皮下注射無菌空氣20mL后，同時將30%蛋清1mL注射與囊內。6h后在急性炎癥期靜脈采血。處死大鼠，用1mL?Hanks液洗滌氣囊，收集洗滌液后離心，取上清液測定各項指標。洗滌液中WBC測定應用細胞計數板測定，同時測定洗滌液中TNFa、MDA含量;血清中MDA含量、SOD活力。滲出液量=洗滌液量1mL。

（5）統計學方法。采用Minitab軟件包進行數據分析，實驗數據以X±SD表示。采用t檢驗和單因素方差分析進行統計分析，P<0.05，有統計學意義。

3?結果與討論

3.1?貓爪草多糖對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響

本試驗察了貓爪草多糖組分PRRT抑制二甲苯所致小鼠耳腫脹的能力，結果表1所示。數據表明，與陰性對照組相比低、中、高劑量的PRRT均可抑制二甲苯所致的小鼠耳腫脹，且劑量越大抑制率越高。其中，PRRT的高劑量組（1600mg/kg）抑制率達35.00%，與陰性對照組相比差別顯著（P<0.05），但低于阿司匹林的抑制率（45.42%）。

3.2?貓爪草多糖對小鼠棉球肉芽腫的影響

本試驗通過稱重棉球肉芽腫的重量來考察貓爪草多糖組分PRRT的抗炎作用，結果如表2所示。數據表明，PRRT高、中、低劑量組對小鼠棉球肉芽腫重量均有減輕作用，且劑量越大抑制率越強。其中，PRRT的中（800mg/kg）、高劑量組（1600mg/kg）抑制率達50%，與陰性對照組相比差別顯著（P<0.05），但均低于阿司匹林的抑制率（18.88%）。

3.3?貓爪草多糖對小鼠腹腔毛細血管通透性的影響

本試驗采用醋酸致小鼠腹腔血管通透性增加來研究貓爪草多糖組分PRRT的抗炎作用，結果如表3所示。數據表明，PRRT的中劑量組（800mg/kg）與陰性對照組相比差別顯著（P<0.05）;PRRT21的高劑量組（1600mg/kg）與陰性對照組相比差別極顯著（P<0.01）。

3.4?貓爪草多糖對大鼠氣囊滑膜炎的影響

本試驗通過大鼠滲出液的體積和血清中的WBC、TNFa、MDA等指標指標來考察貓爪草多糖組分PRRT的抗炎作用和機理。結果如表4、5所示。數據表明，低、中、高劑量組滲出液的體積、白細胞數和TNFα與陰性對照組有一定的降低，但差別不顯著。而中。高劑量組能顯著降低WBC。同時，低、中、高劑量組均能提高SOD的活性，降低MDA含量。說明PRRT有一定的抗炎作用，其抗炎作用可能與改變SOD活性相關。

4?結論

本研究分別通過醋酸致腹腔毛細血管通透性增加和二甲苯致小鼠耳腫脹制作早期炎癥反應模型、大鼠氣囊滑膜炎構建中期炎癥反應模型、棉球肉芽腫構建晚期炎癥反應模型，考察了貓爪草多糖PRRT組分的抗炎作用和機制。結果表明，貓爪草多糖PRRT組分的高劑量組與陰性對照組相比，可顯著抑制小鼠耳腫脹、降低毛細血管通透性及肉芽組織增生，其抗炎機制可能是PRRT可降低血清和滑膜炎滲出液中的MDA含量，提高SOD活性，進而減輕脂質過氧化損傷。

參考文獻：

[1]廖豪，童志平.中藥貓爪草的研究進展[J].中國藥房，2008，12：955957.

[2]陳丙鑾，杭悅宇，陳寶兒.藥用植物貓爪草的研究進展[J].中國野生植物資源，2002，4：79.

[3]李瑞尹，春萍.中藥貓爪草的研究進展[J].中國藥師，2014，3：489492.

[4]胡澤開，苗明三，劉會麗.中藥貓爪草免疫活性部位的篩選[J].遼寧中醫藥大學學報，2010，12（3）：2426.

[5]王魯石，杜華，薛梅，等.貓爪草多糖的提取及含量測定[J].遼寧中醫藥大學學報，2003，21（3）：910.

[6]劉麗娟，張振凌，吳筱菁，等.正交實驗法研究貓爪草多糖超聲提取工藝[J].河南中醫學院學報，2007，6（37）：2930.

[7]王明道，胡虹，郜峰，等.貓爪草多糖的微波提取工藝優化[J].江西農業學報，2011，1（43）：132134.

[8]劉菊，王君明，紀彬，等.貓爪草粗多糖提取工藝研究[J].中醫學報，2012，12（27）：16221623.

[9]陳彥，戴玲，沈業壽.貓爪草多糖RTGⅢ的分離純化及其生物活性[J].中國藥學雜志，2004，39（5）：339342.

[10]吳曉.貓爪草多糖和有機酸部位的初步研究[D].南京：南京中醫藥大學，2007.

[11]賈慧青.貓爪草多糖的研究[D].西安：陜西師范大學大學，2006.

[12]Zhongxia?Zhang?Meiying?Wang?Tianying?Yu.Effects?of?polysaccharides?of?Radix?ranunculi?ternati?on?Type?I?Skin?Hypersensitivity?in?rats[J].Biomedical?Research，2015，26（2）：315319.

[13]王會敏，何柯新，尚陳宇，等.貓爪草多糖的理化性質及其對ANA1細胞的免疫調節作用[J].熱帶醫學雜志，2018，18（7）：855859.

[14]何柯新，呂世靜.貓爪草有效成分抗結核治療進展[J].檢驗醫學與臨床，2008，5（6）：354356.

[15]彭銳，鄒陽.壯筋膏的抗炎鎮痛作用研究[J].湖北中醫學院學報，2007，9（1）：1718.

[16]張文平，陳惠群，張支書，等.千里光總黃酮的抗炎作用研究[J].時珍國醫國藥，2008，19（3）：605607.

[17]王瑋，白月，王俊平，等.黃芩莖葉總黃酮對大鼠氣囊滑膜炎抗炎作用機制的研究[J].臨床與用藥，2009，26（4）：460.