缺血-再灌注對家兔腎臟的病理性損傷及腎微循環內中性粒細胞和微血栓的變化

李曉明

（甘肅農業大學 動物醫學院，甘肅 蘭州 730070）

缺血-再灌注損傷是缺血的器官在恢復動脈血液供應后出現的代謝異常、功能障礙及結構破壞等損傷性變化。現已證實，心、腦、肝、肺、腎、胃腸道和皮膚等多種組織器官都存在缺血-再灌注損傷的現象[1]。雖然缺血-再灌注損傷的發病機制尚未被徹底闡明，但普遍認為自由基的作用、細胞內鈣超載和白細胞的激活是其重要的發病環節[2]。目前，關于腎臟缺血-再灌注損傷的研究主要集中在自由基含量的變化、損傷機制和抗自由基治療等方面，有關微循環中白細胞和微血栓的變化研究甚少。本研究在家兔腎臟缺血-再灌注模型上，通過血管逆流灌注法對腎臟微循環中滯留的白細胞和微血栓變化進行了探討，并對腎臟的病理損傷進行了觀察。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

健康成年中國白兔12只，體重1.5～2.0 kg，雌雄不限。隨機分成對照組和實驗組，每組6只。

1.2 主要儀器與試劑

萊卡切片機，攤片機，顯微鏡，常規手術器械，逆流灌注裝置，無損傷動脈夾，血細胞計數器，20%烏拉坦，1%鹽酸普魯卡因，生理鹽水。

1.3 模型建立

按照5 ml/kg的劑量，給家兔耳緣靜脈注射20%烏拉坦全身麻醉，仰臥固定在手術臺上。下腹部剃毛，用1%鹽酸普魯卡因沿腹部白線浸潤麻醉，正中切口打開腹腔，暴露左腎并分離腎動脈。實驗組家兔用無損傷動脈夾夾閉腎動脈，造成左腎缺血，維持40 min后松開動脈夾，恢復左腎血液再灌注；約90 min后處死動物，取出左腎，進行微循環中白細胞和微血栓的檢測及腎臟的病理學觀察。對照組家兔在分離腎動脈后不做其他處理，直接關閉腹腔，觀察動物一般情況，約130 min后處死動物，進行與實驗組家兔相同的檢測。

1.4 檢測方法

1.4.1 腎微循環中白細胞和微血栓的檢測 分離并取出左腎，觀察其大小、顏色、質地和切面等大體形態變化，然后分別在腎動脈和腎靜脈斷端插管并結扎固定；將腎靜脈插管連接在逆流灌注裝置上。灌流液為37℃生理鹽水，壓力50 cmH2O。打開灌注閥，灌流液經腎靜脈插管流入腎臟，沿著腎靜脈、腎毛細血管、腎動脈的流向進行逆流灌注，并從腎動脈插管回收灌流液。棄去最初的5 ml灌流液，繼續收集15 ml，離心（3000 rpm，20 min），棄上清，保留下層液2 ml，搖勻后在顯微鏡下進行白細胞和微血栓計數（萬/ml）。同時，用混勻的下層液涂片，Wright’s染色法染色，白細胞分類計數，求出中性粒細胞數量。

1.4.2 病理學觀察 從腎臟不同部位取材，10%中性福爾馬林固定。按常規石蠟切片制作流程，梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、石蠟包埋，切片（厚6 μm），HE染色，光鏡下觀察。

1.5 統計學分析

實驗數據用均數±標準差表示，用SPSS10.0 for Windows統計學軟件進行方差分析。

2 結果

2.1 一般狀況

在整個實驗過程中，對照組和實驗組家兔均未出現意外死亡現象。在手術過程中，當用動脈夾夾閉實驗組家兔的左腎動脈后，左腎的顏色迅速由原來的鮮紅色變成黑紫色；松開動脈夾時，恢復左腎血液再灌注后，左腎的顏色迅速由黑紫色變為鮮紅色，說明腎臟的缺血-再灌注模型建立成功。

2.2 中性粒細胞和微血栓數量的變化

由表1可知，實驗組家兔的左腎在完全缺血40 min后恢復血液再灌注，經過1.5 h后，腎微循環中滯留的中性粒細胞和微血栓數量均明顯高于對照組（P＜0.01）。

表1 左腎微循環中滯留的中性粒細胞和微血栓數量

2.3 病理變化

尸體解剖可見，實驗組家兔左腎的體積略腫大，顏色暗紅，表面光滑，被膜緊張，但易剝離，腎切面上皮、髓質界限清晰；鏡檢可知，腎小球血管團膨大，未見明顯充血、出血，腎球囊狹小；皮質部的腎小管上皮細胞彌漫性腫脹，顆粒變性、水泡變性，凸入管腔，使腎小管管腔變小、形狀不規則；部分區域的腎小管上皮細胞嚴重壞死、崩解，細胞內容物進入腎小管內（見圖1）；在皮質深層，大部分腎小管腔內可見均質的蛋白管型（見圖2）。對照組腎臟未見明顯異常。

圖1 腎小管上皮細胞水泡變性、壞死、崩解圖（HE×200）

圖2 部分腎小管內均質的蛋白管型（HE×200）

3 討論與小結

在臨床上，缺血-再灌注損傷是許多伴有血液循環障礙的疾病過程中經常出現的一種病理過程，涉及的組織器官種類多，波及范圍廣，對機體的影響大。現已證實心、腦、肝、肺、腎、胃腸道和皮膚等多種組織器官都存在缺血-再灌注損傷的現象[2,3]。腎臟的缺血-再灌注損傷主要見于急性大失血、休克、腎移植和腎動脈栓塞等疾病的救治過程中，常引起嚴重的腎功能損害。在本研究中，通過人為控制實驗組家兔左腎動脈的血流量，模擬了腎臟的缺血和再灌注過程。結果發現，當夾閉左腎動脈后，左腎很快由正常的紫紅色變為黑紫色，提示腎動脈血的灌注停止，腎臟處于急性缺血狀態；當打開動脈夾后，左腎的顏色又迅速轉為正常的紫紅色，提示動脈血又恢復了灌注。由此可見，通過人為控制腎動脈的血流量，完全可以模擬腎臟的缺血-再灌注過程，說明該模型的建立是成功的。

目前，盡管缺血-再灌注損傷的發病機制尚未被徹底闡明，但普遍認為這類以微血管和實質器官病變為特征的損傷與自由基生成過多、細胞內鈣超載、中性粒細胞及補體系統活化、細胞凋亡異常等因素密切相關，其中氧自由基起著重要作用[3,4]。本研究顯示，實驗組家兔左腎在完全缺血40 min后恢復再灌注，經過1.5 h后，左腎微循環中滯留的中性粒細胞和微血栓數量明顯高于對照組，表明其參與腎臟病理損傷的形成。缺血-再灌注的腎臟血管內大量中性粒細胞的滯留可能與血管內皮表達粘附因子增強有關，滯留的中性粒細胞激活后可產生大量自由基，引起血管內皮損傷，造成血小板粘附和微血栓形成，加重腎臟的血液循環障礙和病理變化的形成。

研究證明，在缺血-再灌注損傷過程中，受損器官內激活的中性粒細胞和血管內皮細胞均可釋放大量的致炎因子，如溶酶體酶、自由基、蛋白酶等，不僅造成血管自身的損傷，還可引起周圍組織細胞病變[5]。本研究觀察到，實驗組家兔的左腎在再灌注后主要表現為腎小球血管團膨大，腎球囊狹小，腎小管上皮細胞彌漫性腫脹，腎小管腔變小、形狀不規則，腎小管上皮細胞廣泛的水泡變性和壞死，部分腎小管內可見均質的蛋白管型。腎小管上皮病變的形成不僅與組織缺血性缺氧有關，還可能與再灌注后局部組織內形成的自由基對細胞生物膜的損傷和溶酶體酶對細胞結構的破壞有關，這種損傷也是最終導致腎功能不全的重要原因。