CYP11A1在牦牛不同級別卵泡及卵母細胞成熟過程中的表達

孫 瑩，王 萌，王靖雷，孫曉軍，馬 睿，余四九，潘陽陽*

（1.甘肅農業大學 動物醫學院，甘肅 蘭州 730070；2.蘭州市動物疫病預防控制中心，甘肅 蘭州 730050）

細胞色素P450（CytochromeP450，CYP450）是可以自身氧化的亞鐵血紅蛋白家族，該家族成員覆蓋了所有生物體，主要分布于細胞線粒體內膜及內質網中，是內、外源性物質及致癌性物質代謝過程中的關鍵酶，參與生物體內甾醇類激素合成的過程[1,2]。有研究表明，在女性生長發育過程中，缺乏細胞色素P450氧化還原酶會引起成年女性月經紊亂，甚至出現不孕現象[3]。哺乳動物卵巢的每個生理周期均會排出處于成熟階段的卵泡用于受精，卵巢對雌性動物的生殖能力起決定性作用。由此可見，提高卵巢生理功能是目前研究的重點目標。

CYP11A1作為細胞色素P450家族的成員，參與催化生物轉化、生物合成的過程[4]。在分子水平上，細胞色素P450CYP11A1通過裂解膽固醇側鏈，催化合成類固醇激素的前體——孕烯醇酮（Pregnenolone），促進卵泡發育及卵母細胞的成熟[5,6]。有研究表明：CYP11A1的酶活性會受到雌激素、孕酮的調控，如雌二醇會影響孕烯醇酮的形成，具有促進卵巢發育、排卵的功能，與動物生長繁殖也密切相關[3][7,8]。

牦牛（Bos grunniens）是中國以青藏高原為中心的珍稀牛種之一[9,10]。它在低溫高海拔、紫外線強的生態環境中生存，為牧民提供皮毛、牛奶、肉制品等多種生物制品，創造了極大的經濟價值。但牦牛生產性能較低，90%以上的雌性牦牛產后同年無法發情，三年兩胎，甚至兩年一胎，生產過程極具局限性[11,12]。前有研究證明CYP11A1對家禽、藏豬、小尾寒羊等多種動物的生殖生理均有所影響，但在牦牛中未見報道[13,14]。因此，本研究以牦牛不同發育階段的卵泡、COCs為模型，應用qRT-PCR、免疫熒光技術檢測CYP11A1的表達水平及位置分布，為進一步了解哺乳動物、反芻動物生殖生理的特異性奠定了基礎。

1 研究方法

1.1 主要試劑

磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）、杜氏磷酸鹽緩沖液（Dulbecco’s phosphate buffered saline，D-PBS）購自Sigma公司（美國）；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）購于PAN公司（澳大利亞）；TransZol RNA提取試劑盒（TransGen，北京）；Evo M-MLV反轉錄試劑盒Ⅱ（艾科瑞生物，湖南）；SYBR GreenⅡ熒光定量PCR試劑盒（寶生物，大連）；CYP11A1 Antibody（親科生物，常州）、免疫熒光檢測試劑購于南京碧云天生物技術有限公司。

1.2 樣品采集

2020年8—12月從青海省西寧市馬佳肴屠宰場采集牦牛卵巢，置于裝有35℃生理鹽水（含青鏈霉素）的保溫壺中，4 h內帶回實驗室。37℃生理鹽水（含青鏈霉素）清洗3遍，用帶有18G針頭的注射器抽取卵巢表面2～8 mm卵泡中的卵泡液，然后與提前37℃恒溫箱內平衡的采卵液（D-PBS＋5%FBS）混勻；混合后的采卵液倒入50 mm培養皿中，靜置后在體視顯微鏡下撿卵，并將卵移入裝有37℃采卵液的培養皿中清洗3次，再轉入卵母細胞成熟的培養液中，在37℃、5%CO2和飽和濕度培養箱中培養。分別收集未成熟卵母細胞（0 h）、成熟12 h、成熟18 h的卵母細胞以及成熟卵母細胞（24 h）各40枚，將每個階段收集的40枚卵母細胞分為2份，一份用于提取RNA，-80℃保存，另一份置于固定液用于后續免疫熒光染色。

1.3 牦牛COCs及卵泡液RNA的提取與反轉錄

根據TransZol RNA提取試劑盒說明書提示，分別提取不同成熟階段（0 h、12 h、18 h和24 h）COCs的RNA，且分別在卵泡大小為0～3 mm、3～5 mm、5～8 mm和＞8 mm時提取卵泡液的RNA，再利用Evo M-MLV反轉錄試劑盒Ⅱ將其進行反轉錄，合成相應的cDNA，分別存于-20℃，用于后續qRT-PCR檢測。

1.4 引物設計

參考GenBank上所公布的牛的CYP11A1基因序列（NM_176644.2），使用軟件Primer 5 設計引物，并將肌動蛋白β-Actin基因（DQ838049.1）設為內參基因，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成引物，詳細信息及反應條件見表1。

表1 CYP11A1引物信息

1.5 qRT-PCR技術檢測CYP11A1基因的相對表達量

使用LightCycler?96 SW 1.1（Roch，Switzerland）實時熒光定量PCR儀。反應體系為模板cDNA 1 μl（500 ng/μl），上、下游引物各0.5μl（0.2 μmol/ml），2*SYBR Green PCRmix 10 μl，補加ddH2O 8 μl使體系至20 μl；反應條件：95℃預變性10 s；95℃變性10 s、退火10 s（具體溫度見表1）、72℃延伸10 s，重復共40個循環，建立4個重復，β-Actin為內參，根據熔解曲線確定反應特異性，利用所得每個樣品的循環閾值（Ct值），通過2-ΔΔCt法分析qRT-PCR所得數據，檢測CYP11A1基因的相對表達量。

1.6 免疫熒光染色技術檢測CYP11A1的表達定位

采用免疫熒光染色對COCs的CYP11A1蛋白進行定位檢測，首先對在4℃用4%多聚甲醛固定后的細胞進行通透處理，使用免疫封閉液孵育1 h，再用CYP11A1抗體4℃孵育過夜，清洗3遍后與二抗孵育結合，再清洗3遍使用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色，最后清洗3遍后封片鏡驗，用奧林巴斯熒光倒置顯微鏡觀察并拍照。

1.7 數據分析

對每組數據進行單因素方差分析（oneway，ANOVA），每組至少重復3遍以上，所有結果用平均值±標準誤表示，用Graphpad prism 7繪制柱狀圖，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 驗證CYP11A1引物特異性

2.1.1 核酸電泳檢測引物特異性 已知CYP11A1、β-Actin PCR產物大小分別為273bp、143bp，以卵泡液、COCs反轉錄所得cDNA為模板進行普通PCR擴增，驗證引物特異性。結果如圖1所示，片段大小與預期一致，條帶成像清晰，無非特異性結合片段，證明該引物特異性良好，可用于后續qRT-PCR檢測。

2.1.2 CYP11A1擴增所得熔解曲線的結果 如圖2所示，通過qRT-PCR擴增，CYP11A1所得產物的熔解曲線是單峰，且出峰位置即為退火溫度。由此可見，該引物特異性及模板質量均良好。

圖1 CYP11A1在卵泡液和卵母細胞中表達的核酸電泳結果

圖2 qRT-PCR檢測CYP11A1擴增所得熔解曲線的結果

圖3 CYP11A1在不同發育階段的卵泡液及COCs中的表達

2.2 qRT-PCR檢測結果

qRT-PCR檢測結果如圖3所示，CYP11A1在卵泡及COCs發育的各時期均有表達。在卵泡液中，相對表達量呈先升高后降低的趨勢，在卵泡大小為3～5 mm時，表達量最高；而在COCs中，0 h時CYP11A1的相對表達量最低，12 h時相對表達量達到最高值，之后又呈現先下降后升高的趨勢。

2.3 免疫熒光染色檢測結果

圖4 蛋白CYP11A1在不同發育時期的卵丘-卵母細胞復合體中的分布

對不同發育時期的COCs（0 h、12 h、18 h、24 h）進行免疫熒光染色處理后，結果如圖4所示，不同時期COCs的卵丘細胞和卵母細胞均表達CYP11A1，其中在成熟18 h的COCs放射冠中熒光信號尤為明顯，其表達位置與骨架蛋白β-Tubulin的位置一致，且通過DAPI細胞核標記顯示，CYP11A1主要在卵丘細胞的細胞質中表達。

3 討論

促性腺激素在哺乳動物的早期卵泡生長發育中發揮著不可或缺的作用。由垂體分泌的促卵泡素（Follicle-stimulating hormone，FSH），與卵泡膜上相應受體結合，卵細胞周圍顆粒細胞增殖，調控營養物質的交換，抑制卵泡閉鎖，促進有腔卵泡和排卵前卵泡的生長發育[15,16]。同時，FSH還具有促進雌激素分泌的功能，所分泌雌激素中雌二醇的活性最高，對第二性征發育和卵巢排卵有積極的調控作用[17-19]。卵泡生長發育后期會分泌大量的促黃體生成素（Luteinizing hormone，LH），有助于孕酮的分泌。孕酮又稱為黃體酮，起到調節黃體功能、保持受精卵在子宮中著床的位置、防止流產的作用[8]。另外，卵巢顆粒細胞分泌的孕酮會受到合成路徑關鍵酶的影響[20,21]。LH的刺激促進類固醇合成急性調節蛋白的表達，有助于促進孕酮的合成分泌[22]。該蛋白將膽固醇轉運到CYP11A1所在的線粒體內膜，由P450CYP11A1基因編碼的細胞色素P450側鏈裂解酶對其側鏈進行裂解，產生孕烯醇酮，孕烯醇酮在CYP11A1脫氫酶活性的作用下發生雙鍵位置異構，生成孕酮[21][23]。由此可見，卵巢中的CYP11A1基因是影響類固醇激素合成的關鍵調控基因，與哺乳動物繁殖力有關[7][24]。惡劣的高原環境可能引起牦牛卵巢損傷和功能障礙，造成了其繁殖性能的特殊性[25]，而本研究表明CYP11A1會對牦牛的生長繁育產生積極影響，對提高牦牛生產性能具有重要的實踐意義。

本研究通過利用qRT-PCR技術對不同發育時期的卵泡及卵母細胞中CYP11A1基因的相對表達量進行檢測，結果顯示CYP11A1基因在卵泡發育早期（3～5 mm）表達量最高，有研究表明雌激素在卵泡發育早期具有積極的刺激作用，而CYP11A1基因調控顆粒細胞分泌雌激素，該機制與本研究結果相互對應。CYP11A1參與卵泡發育的整個時期，但主要集中在早期，為卵母細胞成熟提供充足的營養物質，是整個發育過程的能量來源；在COCs放射冠形成前期，即M-MⅠ期CYP11A1表達量較高，而后顯著下降，推測CYP11A1可能參與放射冠的形成。根據免疫熒光染色結果來看，CYP11A1在放射冠中的熒光更為明顯，推測CYP11A1誘導激素分泌，增強卵丘細胞與卵母細胞間的物質代謝，促進卵母細胞的成熟，但由于CYP11A1蛋白在卵丘細胞和卵母細胞上均有所分布，不排除卵母細胞分泌蛋白作用于卵丘細胞的可能性，具體機制有待繼續進行驗證。

4 結論

本試驗在牦牛不同級別卵泡發育及卵母細胞成熟的過程中對CYP11A1的表達進行定位分析，研究發現，牦牛卵泡及卵母細胞不同時期發育時期均可檢測到CYP11A1的表達，在早中期表達量最高，而CYP11A1在COCs中的表達主要集中在放射冠，推測CYP11A1參與卵泡的發生和卵母細胞的形成，揭示了CYP11A1參與牦牛雌性生殖過程，對卵泡發育和卵母細胞的成熟均起到積極的調控作用。