當歸對血虛大鼠Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶的影響

段樹麗

（靖遠縣畜牧獸醫(yī)技術(shù)服務(wù)中心，甘肅 靖遠 730600）

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物 SD大鼠，雄性50只，SPF清潔級，體重200±20 g。按組分籠飼養(yǎng)，通用飼料喂養(yǎng)，自由飲水，自然光照，溫度20～30℃，適應環(huán)境3 d后進行試驗。

1.1.2 試劑與材料 水合氯醛、乙酰苯肼（上海中秦化學試劑有限公司）、注射用環(huán)磷酰胺（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司）、ATP酶試劑盒（南京建成生物工程有限公司）、當歸樣品采自甘肅岷縣、精密移液器及一次性吸頭、蒸餾水、一次性試管、吸水紙等。

1.1.3 儀器 37℃恒溫箱、酶標儀、動物血液細胞分析儀（南京普朗醫(yī)療器械設(shè)備有限公司）、RE-6000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）、SHB-III循環(huán)水式多用真空泵（鄭州）等。

1.2 試驗方法

1.2.1 當歸水煎液的制備 稱取生當歸240 g，加1 200 ml蒸餾水浸泡1 h，然后煮沸，沸騰后小火繼續(xù)加熱持續(xù)30 min，趁熱過濾，倒出上清液，剩余濾渣加蒸餾水600 ml，繼續(xù)煮沸20 min，倒出上清液，合并2次上清液，過濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至300 ml，然后用蒸餾水定容至400 ml[1]，使其相當于含生藥0.6 g/ml（臨用時以蒸餾水配成所需濃度），置于4℃冰箱中備用。

1.2.2 動物分組與造模 將實驗動物隨機分為5組，每組大鼠10只，分別為正常對照組、模型組和當歸水煎液高、中、低劑量組。

正常對照組用灌胃針投服生理鹽水1 ml/0.1 kg，1次/d，連續(xù)9 d，除正常對照組外，其余各組在試驗第2天和第5天，分別皮下注射20 mg/kg、40 mg/kg的C8H10N2O，注射C8H10N2O 5 d后，其余各組每日腹部皮下注射環(huán)磷酰胺40 mg/kg，連續(xù)4 d[2]。當歸水煎液高、中、低劑量組（低劑量相當于含生藥0.15 g/ml、中劑量相當于含生藥0.3 g/ml、高劑量相當于含生藥0.6 g/ml）灌胃針投服當歸水煎液1 ml/0.1 kg，1次/d，連續(xù)9 d[3]。

1.2.3 取材及處理 各組大鼠分別于末次給藥后2 h水合氯醛麻醉，股動脈無菌取血，檢測血常規(guī)，主要包括血紅蛋白（HGB）等進行計數(shù)[4]。股動脈采血，肝素鈉抗凝，分離血清，按照ATP酶試劑盒說明書，檢測紅細胞Na+-K+-ATP與Ca2+-Mg2+-ATP兩種酶的活性。ATP酶活性以每小時分解1×107個紅細胞產(chǎn)生的無機磷的量表示(單位nmol·10-7·h-1)。

用SPSS軟件中的ANOVA分析正常組和模型組數(shù)據(jù)（p＜0.05），對數(shù)據(jù)進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 一般體征特征

隨著給藥天數(shù)的增加，除正常對照組之外，其余各組大鼠口唇或粘膜淡白無澤，四肢無力或輕度擅毛，毛發(fā)失澤干枯，精神萎靡，行動遲緩，聚堆，耳、尾顏色蒼白而涼，血呈暗紅，嗜睡，體重下降，模型組更為明顯。解剖后可觀察到正常對照組肝臟、脾臟、胸腺正常，模型組胸腺明顯萎縮。當歸水煎液不同劑量組各種免疫器官不同程度淤血，顏色不同程度加深。

2.2 當歸水煎液對血虛大鼠血常規(guī)的影響

與正常對照組比較，模型組大鼠血象顯著降低(p＜0.01)，說明利用乙酰苯肼和環(huán)磷酰胺聯(lián)合造模成功。通過分析、比較發(fā)現(xiàn)當歸水煎液不同劑量對大鼠影響不同，詳細情況見表1。

表1 當歸水煎液對血虛大鼠血象的影響x±s

表2 當歸水煎液對大鼠Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶的影響x±s

2.3 當歸水煎液對大鼠Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶的影響

與正常對照組相比，模型組大鼠紅細胞膜兩種酶活力Na+-K+-ATP和Ca2+-Mg2+-ATP均顯著降低。當歸水煎液高、中、低劑量組紅細胞膜Na+-K+-ATP酶活力和Ca2+-Mg2+-ATP酶活力明顯高于模型組和生理鹽水對照組(p＜0.05)。詳見表2。

3 討論

3.1 血虛模型的建立

有文獻報道[5]中醫(yī)血虛模型建立常用的方法主要有乙酰苯肼[6]、環(huán)磷酰胺[7]等幾種造模方法。在中醫(yī)證型研究中乙酰苯肼誘導血虛模型在血虛動物模型的制作中具有代表性，相關(guān)研究多且已成熟。乙酰苯肼是一種強氧化劑，可干擾紅細胞內(nèi)多種酶的活性，使機體出現(xiàn)溶血性貧血，紅細胞、白細胞和血紅蛋白明顯減少。試驗觀察到注射乙酰苯肼后次日，大鼠即表現(xiàn)精神萎靡，神疲乏力，易驚，行動遲緩，團縮弓腰，口唇、眼瞼、耳廓蒼白，易脫毛，毛蓬豎少光澤，飲水多，進食減少，大便干黑而少等貧血癥狀。

本試驗采用環(huán)磷酰胺和乙酰苯肼聯(lián)合應用造模，研究當歸對血虛模型的改善作用。環(huán)磷酰胺作為細胞毒藥物，損傷外周血細胞、骨髓細胞、白細胞，對后者損傷更明顯。乙酰苯肼能損傷紅細胞，兩者聯(lián)用對血液系統(tǒng)損傷更大，大鼠皮下注射兩種藥能較好地反映中醫(yī)血虛的癥候。隨著環(huán)磷酰胺和乙酰苯肼用量的增加，各組大鼠呈現(xiàn)不同程度的精神萎靡，毛色失去光澤。當歸能夠改善化學物質(zhì)所致血虛小鼠的造血功能，同時具有一定的免疫增強功能，從而達到扶正固本功效，但其補血和促進免疫功能的機理需要進一步研究。

3.2 當歸對血虛大鼠外周血象的影響

本試驗中乙酰苯肼和環(huán)磷酰胺聯(lián)合造模使模型組大鼠的紅細胞數(shù)、白細胞數(shù)、血紅蛋白含量均顯著降低，當歸水煎液高、中、低劑量組能顯著提高血虛大鼠RBC、WBC、HGB水平(p＜0.01)。乙酰苯肼和環(huán)磷酰胺聯(lián)合應用成功造成大鼠血虛，當歸具有良好的補血作用。

3.3 當歸對血虛大鼠Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的影響

Na+-K+-ATP和Ca2+-Mg2+-ATP是細胞膜上重要的酶蛋白，這兩種蛋白酶基因起源相同，此外還有相似的結(jié)構(gòu)功能，能主動將Ca2+、Na+運送到細胞外，攝入Mg2+、K+。Na+-K+-ATP酶是將細胞膜內(nèi)Na+移到細胞外，同時將細胞外的K+移入膜內(nèi)，從而形成兩種離子的分布不平衡；Ca2+-Mg2+-ATP酶的作用是將Mg2+移入胞內(nèi)，將Ca2+移到細胞外，維持內(nèi)環(huán)境的相對穩(wěn)定。血虛模型使能量代謝和離子平衡被破壞，形成膜離子泵功能障礙，導致ATP減少、細胞內(nèi)外離子分布異常，通過增加ATP酶的活性調(diào)節(jié)離子分布、改善機體能量代謝、保護機體免受損傷 。

本試驗中模型組紅細胞膜Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活力明顯低于空白對照組（p＜0.05），模型組紅細胞膜Na+-K+-ATP酶，Ca2+-Mg2+-ATP酶活性顯著性降低（p＜0.01），說明血虛造模型成功 。試驗表明當歸水煎液可增強乙酰苯肼與環(huán)磷酰胺致大鼠血虛模型機體的能量代謝。