木質素與蚯蚓對黑麥草生物量及土壤微生物群落的影響①

孫 月，潘彥碩，曾 軍，吳宇澄*，林先貴

(1 中國科學院土壤環境與污染修復重點實驗室(南京土壤研究所)，南京 210008；2 中國科學院大學，北京 100049；3 西北農林科技大學資源環境學院，陜西楊凌 712100)

木質素是構成植物木質部的復雜高分子化合物，是僅次于纖維素的第二大豐富的植物源材料。作為一種復雜的交叉連接的多酚聚合物，木質素主要由3種類型的對羥基苯基丙基醇(單體醇)組成，即松柏醇(愈創木基型)、芥子醇(紫丁香基型)和香豆素醇(對羥基苯基型)。木質素應用廣泛，可作環氧樹脂、橡膠及熱塑性塑料等的添加劑、高分子原料、動物飼料添加劑以及土壤的改良劑和修復劑。研究發現，木質素能夠提高土壤有效磷含量，促進無機磷向有機磷的轉化，提高磷肥利用率[1]。木質素還可以作為共代謝底物刺激土壤微生物促進多環芳烴的降解[2]。在土壤中，木質素的降解依賴于微生物作用。一般認為，真菌首先解聚木質素，所產生的酚酸類單體化合物經由細菌進行礦化[3]。酚酸類物質屬于自毒物質，可能產生植物化感作用，抑制植物生長[4]。

蚯蚓是常見的土壤動物，被譽為土壤生態系統的“工程師”，在有機質分解和養分循環、土壤理化性質的改良、土壤微生態平衡等方面均有促進作用。許多研究表明蚯蚓能緩解植物生長障礙。例如，蚯蚓能促進酚類物質的降解，抑制化感作用，改善草莓的連作障礙，這種調控主要通過微生物實現[5]；蚯蚓分泌的黏液能促進土壤污染物的去除，同時促進黑麥草生長[6]；蚯蚓還可以與菌根真菌互作，改善植物營養和生長，并協同修復土壤重金屬[7]。

黑麥草(Lolium perenneL.)，屬禾本科黑麥屬，是一種優質的飼草，也常用于污染農田土壤的修復。前期研究表明，木質素對黑麥草的生長有抑制作用[2]，不利于其實際應用。為解決這一問題，有必要利用包括投加蚯蚓在內的各種手段，緩解黑麥草生長障礙，而木質素和蚯蚓對土壤生態系統的作用，也將在土壤微生物群落響應中得到反映。為此，本研究設立了盆栽試驗，以黑麥草為模式植物，研究木質素、蚯蚓及其聯合作用對植物生物量的影響，并通過qPCR和高通量測序深入解析木質素、蚯蚓及其聯合作用對土壤微生物豐度、群落組成的影響，以揭示蚯蚓緩解木質素對植物生長脅迫的作用及其對相關土壤微生物群落的效應。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試土壤：采自江蘇省南京市某鋼鐵廠附近的農田表層土壤。土樣放置室內自然風干，過2 mm篩。土壤的基本理化性質為：pH 6.84，有機質12.7 g/kg，全氮1.3 g/kg，全磷0.57 g/kg，全鉀19.3 g/kg。

供試植物：黑麥草(Lolium perenneL.)，種子購于江蘇省南京市玄武區東郊種業公司。

供試蚯蚓：威廉環毛蚓(Pheretima guillelmi)，購于江蘇省句容市某蚯蚓養殖場。

化學試劑：木質素購于Sigma-Aldrich西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司。

1.2 試驗設計

盆栽試驗于中國科學院南京土壤研究所玻璃溫室內進行，設置4個處理，見表1，每個處理4個重復。試驗采用底部有孔的塑料盆，便于水分瀝出，盆下放置托盤，收集瀝出的水分。加入土壤之前，將孔徑1 mm的尼龍網鋪在盆底，以防蚯蚓游出。每盆包含2 kg土壤，木質素加入量為8 g/kg，充分混勻后加入盆中，加水調節土壤含水量至田間持水量的60%。加入威廉環毛蚓6條/盆，未鉆入土壤的用其他蚯蚓取代，保證每條蚯蚓健壯。黑麥草種子用溫水浸種24 h，經催芽后分別穴播于上述盆缽中，每盆20粒。出苗1周后間苗，每盆留苗10株。溫室培育3個月后收集植物樣品和土壤樣品。每盆用不銹鋼土鉆隨機取5個點土樣混合，并將土樣置于–20℃保存以供微生物分析。

表1 試驗處理Table 1 Experimental treatment

1.3 測定項目及方法

1.3.1 植物生物量測定 植物生物量采用常壓恒溫干燥法測定[8]。

1.3.2 土壤DNA的提取 采用FastDNA Spin Kit for soil 試劑盒(MP Biomedicals, Solon, USA)提取土壤DNA，每個樣品約0.5 g，微量分光光度計(NanoDrop 2000)和瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA的濃度和質量。DNA經10倍稀釋后用于下游分析，以防共提取雜質的干擾。

1.3.3 定量PCR 采用定量PCR方法測定土壤中細菌16S rRNA基因和真菌18S rRNA基因的數量。引物分別是515F/907R[9-10]、nu-SSU-0817-5’/nu-SSU-1196-3’[11]。定量PCR采用SYBR Green方法，每個樣品重復3次?？寺∧繕嘶蛱崛≠|粒后，測定其濃度并計算拷貝數作為標準品，進行梯度稀釋、測定后繪制標準曲線(拷貝數范圍102~ 108copies/μl)，細菌16S rRNA基因標準曲線的R2=0.997，擴增效率117%，真菌18S rRNA基因標準曲線的R2=0.995，擴增效率99%。

1.3.4 高通量測序及數據分析 采用通用引物515F/907R擴增細菌16S rRNA 基因片段，ITS1f/ITS2[12]擴增真菌ITS基因，其中正向引物序列中包含 5 bp 的條形碼(barcode)序列。將PCR擴增后的產物用2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，純化后建立文庫，采用 Illumina MiSeq 系統進行雙向高通量測序(上海美吉)?；赒IIME2分析平臺進行高通量數據分析。序列經拼接、比對后在 97% 相似性水平劃分操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU)，通過與 Silva數據庫(https://www.arb-silva.de/)比較確定細菌序列的系統學分類，通過與Unite數據庫(http://unite.ut.ee/)比對確定真菌序列的系統學分類。

1.4 數據處理

本試驗數據采用SPSS19.0進行單因素方差分析(ANOVA)，用R Studio的vegan包計算布雷距離(bray distance)進行非度量多維尺度分析(nonmetric multidimensional scaling，NMDS)，采用pheatmap包(https://CRAN.R-project.org/package=pheatmap)進行熱圖分析，用Graphpad Prism 5分析作圖，圖中數據均為平均值。

2 結果與分析

2.1 黑麥草生物量

經過3個月的溫室培養，各處理黑麥草的生物量如圖1所示。R處理黑麥草的生物量平均為3.91 g/盆；添加木質素(RL處理)對黑麥草生長的抑制作用明顯，植物生物量平均為2.32 g/盆，抑制率為41%；添加蚯蚓(RE處理)顯著促進黑麥草的生物量，平均達8.70 g/盆；RLE處理中，蚯蚓部分解除了木質素的抑制作用，植物生物量平均達到6.22 g/盆，顯著高于R處理。

2.2 基因豐度

定量PCR測定結果(圖2)顯示，4個處理細菌16S rRNA基因拷貝數在1.21×109~ 2.93×109copies/g。其中R處理細菌16S rRNA基因豐度為2.11×109copies/g，RL處理明顯降低了細菌的基因拷貝數，RE與R處理的基因拷貝數基本相同，表明單一蚯蚓處理對土壤細菌豐度沒有產生顯著效應；RLE處理與RL處理相比，土壤細菌基因拷貝數顯著增加，達到2.93×109copies/g，是RL處理的2倍。

從圖2還可知，4個處理真菌18S rRNA基因拷貝數在1.64×106~ 1.11×107copies/g，趨勢和細菌基本保持一致。木質素明顯降低了真菌的基因拷貝數，而蚯蚓增加了真菌的基因拷貝數，從R處理的6.36×106copies/g增加至RE處理的9.04×106copies/g。木質素、蚯蚓共存下真菌18S rRNA基因豐度的增幅更加明顯，RLE處理的基因拷貝數是RL處理的6倍之多。

2.3 細菌群落

在細菌16S rRNA基因的高通量測序中，RL處理4個重復中有1個未能成功擴增，其余15個樣品共獲得43萬條序列，單個樣品的序列數在9 309 ~43 850，在97% 序列相似性水平獲得9 277個OTU。每個樣品隨機抽樣9 000條序列做OTU 表，在此基礎上對土壤細菌群落組成進行分析。結果顯示，經過3個月的溫室培養，各處理的土壤細菌群落結構出現了顯著變化(圖3A)。R與RE處理聚集在一起，RL與RLE處理聚集在一起，表明木質素對細菌群落結構產生了較大的影響，而蚯蚓對細菌群落結構的影響相對較小。

對相對豐度大于2% 的細菌門進行分析(圖4A)，結果顯示，在R處理中，土壤中的優勢細菌為γ-變形 菌 門(Gamma Proteobacteria)、擬 桿 菌 門(Bacteroidetes)、酸桿菌門(Acidobacteria)、α-變形菌門(Alpha Proteobacteria)，分別占比32.00%、17.09%、16.31%、9.45%；與R處理相比，添加木質素明顯改變了細菌門水平的組成，促進了α-變形菌門、δ-變形菌門(Delta Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、厚壁菌門(Firmicutes)的相對豐度，降低了γ-變形菌門(Gamma Proteobacteria)、酸桿菌門、擬桿菌門的相對豐度；而添加蚯蚓主要促進了α-變形菌門、酸桿菌門和藍藻門(Cyanobacteria)的相對豐度，降低了擬桿菌門的相對豐度；RLE處理與RL處理相比，γ-變形菌門、酸桿菌門的相對豐度有一定的升高，厚壁菌門的相對豐度有一定的降低。

為探究各處理的作用特征，在科水平對相對豐度大于1%，且處理間具有顯著性差異的細菌做熱圖分析(圖5)。根據細菌對木質素的響應，R與RE、RL與RLE處理分別聚為一類，比較可見，蚯蚓對細菌的影響不大，主要顯著富集了酸桿菌的Blastocatellaceae、Pyrinomonadaceae和變形菌的Caulobacteraceae、Rhizobiaceae、Burkholderiaceae等。木質素導致多個科，如擬桿菌中的Lentimicrobiaceae、Prolixibacteraceae、Bacteroidetes vadinHA17，酸桿菌中的Koribacteraceae，變形菌中的Sphingomonadaceae、Methylophilaceae、Archangiaceae、Geobacteraceae，厚壁菌中的Christensenellaceae等豐度顯著增加。

進一步分析各處理中相對富集程度較高的類群，結果如圖6所示。Ignavibacteriales/Other、Lentimicrobiaceae、Methylophilaceae、Prolixibacteraceae、Christensenellaceae、Bacteroidetes vadinHA17、Koribacteraceae、Sphingomonadaceae、Archangiaceae和Anaerolineaceae在R、RE處理中的相對豐度極低，在RL處理中均有較高的相對豐度，而在RLE處理中的相對豐度雖低于其在RL處理中的相對豐度，但大多高于僅加入蚯蚓的RE處理，仍然顯示出木質素的作用。

2.4 真菌群落

在真菌18S rRNA基因的高通量測序中，16個樣品一共獲得181萬條ITS基因序列，單個樣品的序列數為35 534 ~ 73 266，在97% 序列相似性水平獲得1 780個OTU。每個樣品隨機抽樣35 534條序列做OTU 表，在此基礎上分析土壤真菌的群落組成。結果顯示，經過3個月的培養之后，真菌的群落結構發生了一定的變化(圖3B)，R處理與RE處理有一定的分離，表明蚯蚓對真菌群落產生了一定的影響；RL處理與R處理相距較遠，除了一個異常點，提示木質素對真菌群落也同樣產生了較大的影響；而RLE處理卻與R處理聚集在一起，與R處理的群落結構類似。

將相對豐度大于1% 的真菌做堆積圖(圖4B)，可見，在R處理中主要的門是子囊菌門(Ascomycota)、Mortierellomycota、擔子菌門(Basidiomycota)，分別占比75.01%、10.78%、6.25%。木質素促進了擔子菌的相對豐度，降低了子囊菌的相對豐度；蚯蚓同樣提高了擔子菌的相對豐度，降低了子囊菌的相對豐度。但這一趨勢在RLE處理中得到逆轉，相比單一木質素RL處理，蚯蚓加木質素促進了子囊菌的相對豐度，降低了擔子菌的相對豐度。

3 討論

木質素可以被用作土壤改良劑、肥料等，也是具有修復潛力的污染土壤生物刺激材料[13]。本研究中，木質素顯著降低了黑麥草的生物量，這與Wu等[2]的研究結果一致。可能原因是，木質素結構復雜，在其降解過程中會產生酚酸類的小分子化合物[3]，而這些酚酸類物質與生物堿、萜類共同被稱為自毒物質，對植物的生長有抑制作用。Blum[4]發現從植物組織或分泌物中分離出來的多種酚酸類物質會抑制植物生長，劉曉珍等[14]發現引起菊花連作障礙的主要原因包括酚酸類物質的積累和微生物區系的改變。酚酸類物質通過影響植物的膜系統、光合作用、土壤理化性質、酶活性和土壤微生物等，對植物生長產生抑制作用[15]。

在本研究中，木質素對細菌、真菌的數量具有明顯的抑制作用，對細菌、真菌的群落結構也產生了很大的影響。這些變化可能與木質素的降解過程有關。木質素的分解釋放出酚酸類結構單體和甲基，具有不同的降解途徑。從細菌群落分析可以看出，在單一木質素RL處理中富集的Prolixibacteraceae、Bacteroidetes vadinHA17、Christensenellaceae、Sphingomonadaceae、Archangiaceae等門類，在植物生物質降解中常被刺激。例如，Ji等[16]研究發現，秸稈降解過程中后期土壤中Prolixibacteraceae的WCHB1-32和Bacteroidetes vadinHA17類群增加，表明它們可能參與秸稈難降解組分如木質素的分解；Christensenellaceae屬于梭菌目，包括多種潛在的纖維素降解類群[16]；Sphingomonadaceae中的Sphingobium常用作木質素酚酸類單體的模式降解菌，SphingobiumSYK-6的降解途徑已經得到深入研究[3]；Archangiaceae的Anaeromyxobacter主要是參與鹵代芳香化合物的厭氧降解[17]。木質素代謝過程中釋放出大量甲基，可以進入C1代謝，這解釋了木質素對Methylophilaceae的促進作用，提示甲基營養代謝方式的存在[18]。另外，木質素明顯地促進了真菌擔子菌的相對豐度，主要是Tremellomycetes和Agaricomycetes，兩者均具有降解木質素、纖維素和酚類物質的潛力[19]，Agaricomycetes中含有白腐真菌，而白腐真菌能夠分泌胞外氧化酶降解木質素[20]?？偟膩碚f，本研究中的木質素處理導致許多潛在降解菌屬的富集，是木質素分解的有力證據，而分解中釋放大量酚酸，可能是導致木質素脅迫黑麥草生長的主要原因。

蚯蚓是土壤生態系統的重要組分，蚯蚓的活動(取食、消化、排泄、分泌和掘穴)可以影響微生物的數量、活性和群落結構，從而影響植物生長[21]。本研究發現，蚯蚓能夠顯著促進黑麥草的生長，幾乎達到未加蚯蚓處理的2倍。蚯蚓對細菌的數量和群落結構影響不大，顯著富集Blastocatellaceae和Rhizobiaceae等。Blastocatellaceae與多聚物類碳源代謝顯著正相關[22]；Rhizobiaceae的Rhizobium屬于禾草內生固氮菌，具有固氮酶活性、溶磷、分泌植物生長激素等多種性能[23]。蚯蚓對真菌的數量有所提高，可能刺激根際土壤生物活性[24]，促進菌絲向植物傳遞養分作用，從而促進植物生長[25]。

蚯蚓能夠緩解木質素對植物的抑制作用，顯著促進植物的生物量。究其原因，一方面，可能是由于蚯蚓的作穴、攪動活動增加土壤的孔隙度[26]，加速包括木質素在內的土壤養分物質的循環[27]，促進植物吸收，并體現在土壤微生物數量方面；另一方面，蚯蚓可能影響木質素及其酚酸類產物的降解過程，緩解其對植物產生的化感作用，調節微生物群落，從而提高植物的生物量。畢艷孟和孫振鈞[21]發現蚯蚓能夠顯著降低土壤中酚類化合物的殘留，并且其降解過程主要是通過微生物作用。從本文結果可以看到，RLE處理中細菌和真菌rRNA基因拷貝數在4個處理中最高，是RL處理的2倍以上，表明在木質素和蚯蚓組合處理下，微生物活動也增強，這離不開木質素和蚯蚓的共同作用。添加了木質素的土壤經蚯蚓消化道后性質得到改善，有利于細菌對養分的利用，在這過程中蚯蚓分泌的代謝產物如黏液、尿素等，對土壤有機質產生刺激效應，從而刺激細菌的迅速生長[28]。郝月崎等[29]研究發現蚯蚓的加入對細菌和真菌數量的恢復都有一定的促進作用，添加了蚯蚓的處理組土壤pH更接近中性，可溶性有機碳含量更高，為土壤微生物提供了適宜的生長環境。對于木質素的潛在降解菌Prolixibacteraceae、 Sphingomonadaceae、Methylophilaceae等，在木質素蚯蚓組合處理中，雖然其相對豐度比單一木質素處理略有降低，但鑒于微生物總體數量的增加，它們的絕對豐度或活性很可能得到提高。這些結果表明蚯蚓可能在培養過程中影響了木質素的降解過程，緩解了其分解過程中產生的酚酸類物質對植物的化感作用，從而促進了黑麥草的生長。張尊昊[30]在蚯蚓堆制處理花生殼的研究中發現，接種蚯蚓處理的羧甲基纖維素酶、微晶纖維素酶等酶活力高于未接種蚯蚓對照處理，纖維素、半纖維素、木質素的降解率也明顯高于未接種蚯蚓對照處理。對于真菌而言，蚯蚓改善了木質素對真菌群落結構的影響，盡管RLE處理的擔子菌相對豐度相對RL處理有所降低，但RLE處理的真菌數量幾乎是RL處理的6倍以上，木質素降解菌的絕對豐度很可能得到提高，菌絲對養分的傳遞作用也可能得到增強。總體而言，蚯蚓可能在改善土壤微結構的同時，調節土壤微生物群落，影響了木質素及其酚酸類產物的降解，促進了養分供應，從而促進了黑麥草的生長。

4 結論

木質素顯著降低黑麥草的生物量，蚯蚓可以緩解木質素對黑麥草的脅迫作用。木質素影響土壤微生物群落，潛在木質素降解菌的富集表明木質素發生降解，而降解過程中釋放出的酚酸類化感物質，可能是導致黑麥草生長受阻的主要原因。蚯蚓和木質素的聯合作用，改善了土壤微生物群落結構，顯著增加了細菌和真菌的數量，并改變了木質素降解菌的豐度，可見蚯蚓通過調節土壤中木質素及其酚酸類產物的轉化，緩解其對植物的化感作用，從而改善植物的生長狀況。本研究可為農業生產中木質素類物質的資源化利用提供科學依據。