籽粕熏蒸對哈密瓜發病土壤真核微生物群落組成和變化的影響①

彭俊偉，申民翀，董元華，李建剛*

(1 中國科學院土壤環境與污染修復重點實驗室(南京土壤研究所)，南京 210008；2 中國科學院大學，北京 100049)

哈密瓜是主要的設施大棚作物之一，我國的種植面積和產量居世界之首[1]。但由于國內大棚栽培管理中存在很多誤區，對種植中出現的土傳病害尚無有效防治措施，導致了巨大經濟損失。在哈密瓜設施大棚種植中，連作是產生土傳病害的主要原因，而根際微生物區系失衡是連作障礙發生的重要原因[2]。長期連作條件下，作物根系分泌物會持續誘導病原菌在根系的定殖和侵染，從而造成病害的發生[3]。哈密瓜的土傳病害主要有枯萎病、蔓枯病、根腐病等[4]，是由土壤中的尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)、蔓枯病菌(Didymella bryoniae)等侵染所致[5]，其使植物組織受到損傷，對作物生長產生非常不利的影響，極大地降低哈密瓜產量和質量，嚴重時甚至直接導致作物死亡，造成絕收現象。

目前針對土傳病害問題，主要通過種植管理和土壤消毒兩種方式進行防控。種植管理通過抗病品種選育、種苗消毒、嫁接以及農藥等措施來降低病害，但并未從根本上解決植物病害的發生；土壤消毒則以消滅病原物的方式對病害進行防控，主要利用氯化苦、棉隆等化學藥劑在作物種植前對土壤進行熏蒸處理。熏蒸技術高效快捷，得到廣泛的運用，但高毒性的熏蒸劑，如氯化苦，往往存在著不容忽視的環境問題。棉隆雖然屬于低毒類消毒材料，但有研究表明其在土壤中的分解產物會對環境中生物產生一定毒性，在使用時存在一定的環境安全風險[6]。另外，也有人認為化學熏蒸劑的使用不利于土壤中有益微生物的群落構建，從長遠來看可能會加劇土壤病害[7]。

油菜籽粕本身作為一種天然綠色有機物，能為土壤肥力作出貢獻，促進土壤碳、氮代謝的調節[8]，重要的是其有作為土壤熏蒸劑的潛力來防治土壤病蟲害，很多研究表明籽粕在促進作物生長和抑制病原菌方面都具有顯著效果[9-10]。籽粕的熏蒸潛力來源于其富含的硫代葡萄糖苷，此類物質水解可產生有廣泛殺菌性的次級產物[11]，因此當籽粕作為熏蒸材料加入土壤后，會抑制土壤中病原菌的生命活動，從而影響微生物的群落組成。有研究者對籽粕熏蒸處理后的土壤進行微生物組成分析，發現籽粕的加入顯著降低了胡椒枯萎病菌的相對豐度，從而抑制了病害的發生[12]。此外，與傳統化學熏蒸劑相比，除了綠色無害，籽粕還能更持久地抑制土壤中某些有害生物，從而更長效地對病害起到防控效果[7]。

為探究籽粕用于哈密瓜土傳病害防治的效果以及對土壤中真核微生物群落的影響，本研究利用十字花科籽粕和傳統化學熏蒸劑棉隆作為熏蒸材料，對土壤中真核微生物的動態變化過程作了探討，分析了籽粕與棉隆對土壤微生物的影響，并結合真核微生物群落與作物發病情況，評估了其相互間的關系，以為籽粕用于哈密瓜病害防治技術的研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗地位于安徽省亳州市譙城區哈密瓜種植基地(33°45′N，115°40′E)，該基地大棚內常年連作哈密瓜，多種土傳病害相伴發生，作物病害嚴重。

用于試驗地熏蒸的籽粕，由油菜籽壓榨油料后的殘渣經粉碎過篩(2 mm)得到，分為白菜型(Brassica campes)和芥菜型(Brassica juncea)兩種類型，分別購于甘肅省天水市和新疆阿克蘇地區。用作陽性對照使用的化學熏蒸農藥棉隆(Dazomet，純度98%)購于武漢遠成共創科技有限公司，有廣譜的殺菌和殺蟲作用。

1.2 試驗方法

試驗開始于2019年7月中旬，同年10月底結束。在哈密瓜種植前翻耕土壤，深度15 cm左右，盡可能碎土以增加土壤孔隙度。翻耕后用水澆透供后續熏蒸材料更好地發揮功效，待土壤相對濕度為50% ~ 70%，加入熏蒸材料，白菜型和芥菜型籽粕的用量均為2.2 kg/m2，棉隆根據當地使用經驗以40 g/m2的用量添加。加料后通過翻耕機將料物均勻混入土壤中，并立刻用塑料薄膜覆蓋試驗地，四邊用土壓實提供密閉的熏蒸環境。處理2周后揭膜散氣，后續哈密瓜種植按當地常規管理進行。試驗共設置4個處理，分別為對照(CK)、白菜型籽粕(B)、芥菜型籽粕(J)和棉隆(ML)，每個處理設置4個小區，每個小區長6.5 m、寬5.5 m。在整個土壤處理和后期種植過程中，對土壤共進行4次取樣，分別為熏蒸處理前(T1)的混合土壤，熏蒸處理后(T2)的小區土壤，苗期(T3)的小區土壤以及成熟期(T4)的根際土壤。并在成熟期(T4)時隨機取樣統計各小區單果重量，同時統計各處理小區內所有植株的病株率從而計算防效，計算方式如下：病株率(%)= 病株數/總株數×100，防效(%)= (對照病株率–處理病株率)/ 對照病株率×100[13]。

1.3 真核微生物群落組成測定

DNA提取：采用MP Biomedicals公司的FastDNA Spin Kit for Soil 土壤DNA提取試劑盒提取土壤微生物總DNA，供后續微生物18S rRNA基因的測序。

測序及分析：DNA樣品經檢測、PCR擴增、純化、建庫后在NovaSeq平臺對樣品18S rDNA的V4區域(528F ~ 706R)進行測序；測序后的下機數據進行拼接、質控和過濾，得到用于后續分析的有效數據；對有效數據以97% 的一致性進行OTUs(operational taxonomic units)聚類，然后對OTUs的序列進行物種注釋，得到對應的物種信息和基于物種的豐度分布情況。

1.4 數據處理

使用OTUs序列數據基于加權Bray-Curtis距離進行UPGMA聚類和PCoA主坐標分析，評估不同處理下的微生物群落結構；并通過ANOSIM相似分析檢驗各處理間的群落結構差異；通過FunGuild對根際微生物進行功能預測；基于t檢驗檢測主要微生物的豐度差異，并通過Pearson相關性分析評估主要微生物與哈密瓜發病率間的相關性。分析和繪圖采用SPSS 21.0、R 3.5.3和Origin 9.0軟件。

2 結果與分析

2.1 籽粕處理后哈密瓜的生長和發病情況

哈密瓜的生長和發病統計結果顯示，籽粕的加入能夠顯著降低哈密瓜病株率并增加其產量，而棉隆處理僅對防效有幫助，對增產作用并不顯著(表1)。與對照組51.13% 的病株率相比，經白菜型、芥菜型籽粕和棉隆熏蒸處理的哈密瓜病株率均顯著降低，分別僅有25.94%、23.18% 和22.74%，防效達到了49.26%、54.66% 和55.53%。在作物生長方面，籽粕的加入促進了哈密瓜的生長，白菜型和芥菜型籽粕處理后的哈密瓜單果重較對照組分別提高了18.66%和10.04%，而棉隆處理對果實質量的增加并不顯著(P>0.05，表1)，說明相較于棉隆，籽粕作為熏蒸劑對哈密瓜的生長有更好的促進作用。

2.2 籽粕對土壤真核微生物多樣性的影響

加入籽粕在前期較棉隆更大程度地降低了土壤中真核微生物的豐富度和多樣性，且在后期有更加明顯的恢復趨勢(圖1)。白菜、芥菜型籽粕熏蒸處理后土壤(T2)中的物種豐富度和多樣性結果相似(圖1，P>0.05)，物種數目和Shannon指數分別為529、586和3.9、4.5，但均顯著低于對照組(圖1，P<0.05)；苗期(T3)土壤中微生物多樣性結果變化不大，但在成熟期(T4)的根際土壤中，籽粕處理下的微生物豐富度和多樣性得到了恢復，白菜、芥菜型籽粕處理下的物種數目分別上升到691、805，與對照組的差異較前期明顯減小，Shannon指數也分別上升到了4.48和5.01，與對照組間無顯著性差異(圖1，P>0.05)。棉隆處理對前期(T2、T3)土壤中微生物的多樣性無顯著影響，但顯著影響了物種豐富度；而在成熟期(T4)根際土壤中，棉隆處理對微生物的物種豐富度和多樣性均有顯著影響，物種數目和Shannon指數分別僅有569和3.38，顯著低于對照組和籽粕處理組(圖1，P<0.05)。

表1 不同處理哈密瓜的生長和發病情況Table 1 Growth and incidence of cantaloupe under different treatments

群落多樣性的結果說明，籽粕和棉隆處理對土壤中微生物的改變方式和過程存在差異，籽粕處理會影響土壤中微生物的豐富度及多樣性，而棉隆處理的影響僅體現在豐富度上，且籽粕處理相較于棉隆處理，存在微生物群落的恢復過程，不會顯著降低根際微生物的豐富度和多樣性。

2.3 籽粕對土壤真核微生物群落結構的影響

基于Bray-Curtis距離算法，使用UPGMA聚類和PCoA主坐標分析方法評估籽粕和棉隆處理在時間尺度上對土壤和根際真核微生物群落結構的擾動，分析時間和不同熏蒸處理對群落結構的影響。結果表明，在UPGMA聚類樹和PCoA主坐標圖中，同一時間點的處理間距離更近，相似度更高，按照哈密瓜生育期主要可劃分為哈密瓜作物種植前(T1，熏蒸處理前；T2，熏蒸處理后)和種植后(T3，苗期；T4，成熟期)兩大分支(圖2)，說明微生物群落結構在時間尺度上的區分更為明顯。進一步分析不同熏蒸處理對微生物群落結構的影響，發現籽粕處理相對于棉隆處理，能更顯著地改變土壤中微生物群落。ANOSIM相似性分析表明，除了T3時期的芥菜籽粕處理，兩種籽粕處理在熏蒸后(T2)和種植期(T3、T4)均能明顯影響微生物群落結構，與對照組間存在顯著差異(表2，P<0.05)，而棉隆處理的群落結構僅在苗期(T3)與對照組間有顯著差異(表2)。

微生物群落結構的差異結果說明，籽粕與棉隆處理對真核微生物的擾動是存在顯著差異的，白菜和芥菜型籽粕能更顯著地引起土著真核微生物群落的改變，并且這種改變是持續在整個生產過程中的。

表2 相似性分析(ANOSIM)評估籽粕和棉隆處理在T2 ~T4時期對微生物群落結構的影響Table 2 Analysis of similarities (ANOSIM) to assess effects of seed meals and dazomet on microbial community compisition from T2 to T4 periods

2.4 籽粕對土壤真核微生物群落動態變化和根際真核微生物富集的影響

籽粕和棉隆處理均能引起土壤中真核微生物群落的變化，但其在微生物削減、微生物恢復和最終的根際微生物定殖方面都有顯著不同。在白菜和芥菜籽粕熏蒸處理后(T2)，土壤中的主要門水平真核微生物較對照發生了顯著的豐度變化，而棉隆處理下的主要微生物基本沒有呈現明顯的豐度變化。土壤中最主要的微生物群子囊菌門(Ascomycota)相對豐度高達54.65%，在白菜和芥菜籽粕處理后顯著減少到15.57% 和24.74%，下降了39.08% 和29.91%；另一個未定義的門(unidentified_Eukaryota)作為主要微生物群，其相對豐度達到18.86%，在白菜和芥菜籽粕處理下相對豐度也顯著下降了14.19% 和14.37%；而被孢霉門(Mucoromycota)在白菜和芥菜籽粕處理后相對豐度得到大幅提升，在2.79% 的基礎上分別提高了41.45%和44.50%；此外，在棉隆處理中，主要微生物群中僅被孢霉門相對豐度顯著提升了9.00%，其他主要門水平微生物與對照組間無顯著性差異(圖3A)。

熏蒸處理后(T2)到苗期(T3)的這一階段，對照和棉隆處理中主要門水平微生物基本無顯著變化，但白菜和芥菜籽粕處理下的微生物發生了顯著變化(圖3B)。較熏蒸處理后(T2)，苗期(T3)時的白菜和芥菜籽粕處理中的子囊菌門(Ascomycota)相對豐度得到了恢復和顯著提升，分別增加了54.78% 和38.40%；而毛霉菌門(Mucoromycota)和鏈形植物門(Streptophyta)的相對豐度在T2和T3時的差異雖不顯著，但呈現了降低的變化趨勢(圖3B)。

在哈密瓜成熟期(T 4)的根際土壤中，通過FUNGuild功能預測對主要微生功能群進行分析，在結果中出現3個潛在的植物病原菌群，且這3種功能菌群在白菜和芥菜籽粕處理下的含量要明顯低于對照和棉隆處理(圖4)，說明這兩種籽粕處理都有效地抑制了根際相關病原菌的定殖，有利于根際微生物群落的構建。為探究不同熏蒸處理對根際微生物群落構建的影響，在屬水平上比較了各熏蒸處理與對照組間的主要微生物豐度差異(圖5)。結果發現，主要有以下屬在熏蒸處理和對照間具有顯著性差異：曲霉菌屬(Aspergillus)、枝孢屬(Cladosporium)、毛殼菌屬(Chaetomium)、殖口蟲屬(Gonostomum)和被孢霉菌屬(Mortierella)。其中曲霉菌屬在白菜和芥菜籽粕處理中的相對豐度高達26.97% 和19.68%，顯著高于對照組的5.25%；毛殼菌屬的差異僅出現在芥菜籽粕處理與對照組間，相較于對照組中相對含量僅有0.96%，其在芥菜籽粕中的相對豐度上升到了5.13%。這兩個屬在對病害的防治中起到了重要的作用，在相關性分析中呈現出了與疾病間顯著的相關性(表3)。曲霉菌屬與發病率間呈顯著的負相關關系(r= –0.526，P= 0.036)，且通過更近一步的物種分析可發現，曲霉菌屬下的主要種慢性曲霉(Aspergillus lentulus)與發病率間也呈顯著負相關關系(r= –0.505，P= 0.046)；而毛殼菌屬雖然于發病率間沒有顯著相關性，但其下種OTU_213與發病率間呈現了顯著的負相關關系。說明慢性曲霉菌和毛殼菌屬下種OTU_213也許能對哈密瓜病害的防治起到關鍵作用，屬于根際的抗病有益菌。

表3 關鍵物種與發病率的Pearson相關性分析Table 3 Pearson correlation coefficients of key species and incidence rate

3 討論

對土壤進行籽粕熏蒸處理后，土壤中某些微生物的生長因其水解產物的毒性作用受到抑制，整體上呈現出豐富度和多樣性顯著下降的趨勢，但這種趨勢在作物成熟時消失，微生物多樣性恢復到與對照組同一水平(圖1)。這一結論與前人的籽粕防病研究結論相似，籽粕處理下真菌群落微生物與對照間的差異度在作物種植后顯著減小[14]。與棉隆處理對土壤豐富度和多樣性單一的削減不同，籽粕處理對土壤中微生物的變化影響更為復雜，會經歷生物削減和恢復兩個過程。

雖然籽粕廣譜的滅生性使微生物多樣性整體下降，但其能抑制作物根際病原菌的定殖并促進獨特微生物的富集，構建特異的微生物群落結構[6]，而這種微生物群落可能在一定程度上也會產生揮發性有機物質，使病原真菌細胞膜或抗氧化系統功能異常[15]，起到進一步的熏蒸抑病效果。盡管在本試驗中并未發現哈密瓜主要致病菌(腐霉屬(Pythium)和鐮刀屬(Fusarium)真菌)在處理間的顯著差異，但FunGuild分析結果表明(圖4)，籽粕處理確實對一些潛在植物病原菌存在綜合抑制作用，使得根際微生物的病原菌數量減少，從而達到抑病效果。油菜籽粕對土壤中多種病原菌有抑制效果[16-17]，而土壤中的籽粕養分含量會驅動微生物群落結構的轉變[18]，促進一些有益微生物的富集。在籽粕作用下，一類關鍵真核微生物子囊菌門(Ascomycota)經歷了顯著的變化，影響了微生物群落的構建，該門經過籽粕熏蒸作用后相對豐度先是顯著降低(圖3A)，然后在后續作物種植過程中又迅速恢復和擴繁，重新占據了土壤環境中的主要生態位(圖3B)。而在哈密瓜生長后期，子囊菌門中的一些特定物種也作為有益微生物參與了根際微生物的構建，與病害間呈現出顯著的負相關關系(表3)。由于籽粕中特有的高碳氮含量會促進腐生真菌的繁殖[19]，使得子囊菌門下的曲霉菌屬(Aspergillus)相對豐度得到提升，出現可能可以抑制病原菌的有益微生物。有研究利用曲霉菌屬下的Aspergillus flavus、Aspergillus niger和Aspergillus terreus實現了對哈密瓜病原菌F.oxysporumf. sp.melonis的抑制[20]。在本研究中，發現曲霉菌屬下慢性曲霉(Aspergillus lentulus)與哈密瓜發病率間呈顯著負相關性(表3)，可能是作為有益菌存在于根際中，對有害微生物起到了拮抗作用，從而抑制了相關功能病原菌群在根際的定殖(圖4)。同樣可能與抑病有關的還有芥菜型籽粕處理下富集的毛殼菌屬(Chaetomium)，該屬下的一些微生物對病原性鐮刀菌(Fusarium)具有拮抗作用[21-22]，通過深入分析也發現，本研究中毛殼菌屬下的一個未知種(OTU_213)與哈密瓜發病率間具有顯著的負相關關系(表3)，可能也屬于一類有益菌定殖于根際發揮抗病作用。

在白菜和芥菜籽粕的生物熏蒸過程中，滅生作用以及慢性曲霉和毛殼菌屬下物種OTU_213的富集可能共同促進了根際微生物中病原功能菌的減少，從而降低了作物的發病率。但兩種籽粕在土壤中水解次級產物和養分含量的不同，可能造成了它們具體抑菌效果和群落結構的差異[11]。而相較于不同籽粕類型間的差異，不同熏蒸材料棉隆與籽粕處理間的差異更為明顯，且單一成分的化學熏蒸劑棉隆在根際對病原菌的抑制和有益微生物的富集方面均不如籽粕，對整體微生物群落結構的改變主要集中在前期熏蒸的環節，在后期微生物群落的恢復以及有益微生物群落的構建方面并沒有起到明顯的幫助作用，因此棉隆的化學熏蒸抑病效果可能沒有籽粕持久，不能像籽粕一樣形成生物屏障抑制土壤病原菌的定殖和二次侵染[23]。此外，棉隆廣譜的殺菌性會降低非靶向微生物活性和數量，并不利于改善土壤生產力[24-25]，也不利于農業生態的可持續發展。

4 結論

白菜型和芥菜型籽粕處理土壤能夠對哈密瓜土傳病害起到顯著的防治作用，雖然防治效果與棉隆處理相似，但在對微生物群落動態變化的影響上有明顯差異，且在后期根際微生物富集方面，兩種籽粕處理減少植物病原菌群定殖的同時產生了可抑制病原菌的有益微生物。整體上，兩種籽粕通過對特定土著微生物的滅殺、恢復和富集過程，實現了對根際有益微生物的篩選，起到了對哈密瓜病害的防控作用，是一種較傳統熏蒸劑更為綠色科學的病害防控材料。