多菌靈降解菌djl-6和啶蟲脒降解菌D-2固體菌劑的研發①

徐銘陽，盧家森，孟獻雨，林澤彬，何 健，黃 星

(南京農業大學生命科學學院，南京 210095)

目前農藥殘留降解菌劑大多為液體劑型，其長距離運輸不方便，保存期較短。固體劑型相對于液體劑型而言，其保存期長、運輸及施用方便[1-3]。但目前對于農藥殘留降解菌的固體劑型的研究很少。微生物固體菌劑的研究大多采用載體吸附方法，應用于菌劑吸附的載體應具有對微生物無毒、抗微生物分解、易于攜帶運輸、價格低廉等特點[4-6]。目前研究常使用的載體有土壤、珍珠巖、淤泥、泥炭、硅藻土、菌糠、米糠、秸稈、蛭石、有機堆肥、海藻酸鈉、鋸末、煤炭、高嶺土等[7-9]。載體材料大多都具備多孔的結構，可以容納不斷進行增殖的接種微生物，從而使得載體內接種微生物的密度增大。

微生物固體菌劑的質量優劣主要體現在3個方面，一是菌劑要有良好的適應能力，微生物的活性強；二是要有較長的貨架期；三是要有較高的有效活菌數和較低的雜菌污染率[10-12]。基于此，本文首先利用常見的載體泥炭、花生殼粉、米糠以及有機堆肥來吸附菌劑。菌劑中所含的多菌靈及啶蟲脒降解菌株由本實驗室分離并保藏，所用的多菌靈降解菌株djl-6在3 d內將100 mg/L多菌靈降解100.0%，啶蟲脒降解菌株D-2在3 d內將50 mg/L啶蟲脒降解99.0%[13-14]。然后以泥炭作為對照，探究有機堆肥作為吸附載體的微生物菌劑的活菌數量變化及其保存期，并通過盆缽土壤試驗檢測了保藏后的菌劑的降解效果。本文的研究可以為降解菌固體菌劑的應用和保存提供一些理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

供試載體：泥炭、米糠、花生殼粉購自晟圖園藝有限公司，蚯蚓糞有機肥、雞糞有機肥、豬糞有機肥、秸稈有機肥購自南京易循環農業科技有限公司，上述各供試材料均在自然狀態下風干3 d后過40目篩，經121 ℃ 間歇式高壓濕熱滅菌后備用。

多菌靈原藥購自江蘇新沂農藥廠(純度99.8%)。啶蟲脒原藥購自綠源制藥(純度98.3%)。

1.2 供試菌株與土壤

多菌靈降解菌株Rhodococcus qingshengiidjl-6、啶蟲脒降解菌株Pigmentiphagasp. D-2，均由本實驗室分離并保藏。

供試土壤為黃棕壤，采集于南京農業大學牌樓實驗基地。土壤基本理化性質：pH 6.91，全氮 0.86 g/kg，有效氮15.76 mg/kg，全磷0.32 g/kg，有效磷 7.95 mg/kg，全鉀1.41 g/kg，有效鉀80.27 mg/kg，有機質15.12 g/kg，總碳 6.84 g/kg。

1.3 載體材料基本性質測定

各供試載體的含水率采用烘干法[15]進行測定；pH采用pH儀測定[16]；氮、磷、鉀含量分別采用半微量凱式定氮法、鉬銻抗試劑測定法以及氫氧化鈉熔融-原子吸收分光光度計法測定[17-18]；每個載體設3個重復，最終結果取3次測定的平均值。

準確稱取100 g已滅菌的載體材料放于封口袋內，在無菌條件下，按照一定梯度加入無菌水到載體材料中，并用玻璃棒將載體與無菌水進行充分的攪勻混合，直至載體與無菌水混勻且載體疏松、濕潤不成塊。以100 g干燥的滅菌載體所能吸附的水分作為載體的吸水率，每個處理設置3個重復，取3次試驗的平均值作為載體的吸水率。

1.4 載體對菌株生長的影響

準確稱取經滅菌后的不同載體各20 g，分別加入到盛有200 ml去離子水的三角瓶中，然后置于30 ℃搖床中150 r/min振蕩24 h。振蕩后取4 ml加入到已滅菌空試管中，進行高溫滅菌。滅菌后再向其中每個試管中分別加入0.1 ml的菌株D-2和菌株djl-6的種子液，置于搖床中于150 r/min、30 ℃條件下繼續培養，分別于2 d和4 d進行取樣，利用稀釋涂布平板法計數。通過與原始接種菌液中的菌數進行比較，判斷載體是否對降解菌菌株的生長有抑制作用。每個處理設置3個平行。

1.5 載體的單一最大吸菌量

準確稱取已經滅菌的不同載體各2 g分裝到50 ml干凈的滅菌離心管中，將各載體分別與10 ml降解菌菌株D-2和djl-6的菌液在常溫條件下吸附5 h，放置于離心機中以4 ℃、1 000 r/min離心10 min，離心后傾去上清液，繼續向沉淀中加入10 ml 無菌水，于渦旋儀上充分振蕩5 min后，再次置于離心機中以4 ℃、1 000 r/min離心10 min，傾出上清液，測定其中的活菌數。重復3次，3次測得的總菌數除以加入的載體質量即為單位載體的單一最大吸菌量[19-20]，每個處理設置3個平行。

1.6 菌劑的有效菌數釋放率

將載體菌劑制備后置于陰涼處室溫保存2 d，然后取2 g加入到裝有玻璃球的20 ml無菌水中，以150 r/min條件下振蕩2 h，取出后立即采用稀釋涂布，測定菌劑中釋放的有效活菌數，每個處理設置3個平行。有效菌數釋放率(%)=載體菌劑釋放的有效菌密度/接種的細菌密度(cfu)×100

1.7 菌劑活菌數檢測

采用稀釋涂布平板法，分別準確稱取不同處理的菌劑2 g加入到盛有20 ml無菌水的三角瓶中，并在其中放置玻璃珠；靜置30 min后置于搖床中，充分震蕩30 min，得到的菌懸液即為10–1菌懸液。將菌懸液吸取1 ml加入到盛有9 ml無菌水的試管中繼續稀釋，如此重復，將稀釋液稀釋到合適的濃度梯度后，分別吸取0.1 ml稀釋液涂布于固體LB培養基的平板上，每個處理設置3個平行，每個梯度設置3個平行，培養3 d后進行菌落計數。

1.8 菌劑含水率的變化

將菌劑制備后放置于陰涼處保存，于120 d時稱取不同菌劑處理各5 g，進行載體菌劑的含水率測定。含水率采用烘干法測定[15]。

1.9 土壤農藥殘留降解

在供試土壤中分別加入多菌靈和啶蟲脒的水溶液，攪拌均勻，使土壤中多菌靈和啶蟲脒濃度分別為5 mg/kg干土和10 mg/kg干土。用清水調節土壤含水率為20%，靜置3 h后使啶蟲脒和多菌靈能夠充分被土壤吸收。在無菌條件下準確稱取保存30 d的各個載體菌劑20 g，與含有多菌靈和啶蟲脒的180 g供試土壤進行混勻，將其分裝于兩層一次性塑料杯中，用黑色塑料袋遮蓋防止農藥的光解，向其中加入無菌水至其含水量為20%；并設置加入農藥而不加降解菌的對照。置于光照培養箱中，模擬自然環境，白光照射12 h，溫度為26 ℃，黑暗狀態12 h，溫度為20 ℃。分別于第3、5、7、10天取不同處理的土樣萃取后，采用HPLC檢測土壤中多菌靈和啶蟲脒的殘留量。

2 結果與分析

2.1 載體材料的基本性質

載體的吸水能力直接影響菌株的生存，載體吸水率是一個表征菌劑質量的指標。在自然條件下風干3 d后的載體的吸水能力如表1所示，在普通載體中以花生殼粉和米糠吸水率最高，分別達到了96.00% 和87.33%，泥炭吸水率最低，僅為63.67%；而在有機肥載體中，雞糞肥吸水率最低，僅為58.00%，秸稈肥吸水率最高，達到了73.00%。載體作為菌劑吸附的基質，為微生物的生長提供水分。在一定范圍內，載體的吸水率越高，說明載體的持水能力越強，保水能力也就越強，過多的水分也能夠疏泄出去。

表1 不同載體的吸水率、含水率、pH 和營養成分Table 1 Water absorption, water contents, pH values and nutritional contents of different carriers

自然條件下風干后的載體含水率不宜過高，過高會產生霉變，過低又難以供給接種微生物的日常需求，因此載體的含水率對于菌劑來說也至關重要。不同載體的含水率如表 1所示，不同載體之間含水率差異明顯，載體自然條件下風干3 d后的含水率介于7.09% ~ 16.70%。在普通載體中以泥炭處理最低，為7.09%，而含水率最高的處理為米糠，高達10.60%；在有機肥類載體中，含水率為11.10% ~ 16.70%，其中豬糞有機肥的含水率最高，為16.70%，秸稈肥最低，為11.10%。各載體自然狀態下的含水率能夠滿足接種微生物的生長。

pH是一個影響微生物生存的重要因素，絕大多數微生物生存的pH介于6 ~ 8。而本研究所用的兩株降解菌的生長及降解也隨pH變化而產生影響。常規載體pH變化的幅度較小，幅度僅為0.84，常規載體均呈現出弱酸性，其中以花生殼粉最低，為5.95，泥炭最高，為6.79；而有機肥類載體方面pH幅度較大，為1.47，其中以豬糞肥最高，為8.30，蚯蚓糞肥最低，為6.83。

不同載體的營養成分見表1，其中花生殼粉的氮、磷、鉀含量最低，分別為1.70、0.60和2.60 g/kg。全氮含量最高的載體為豬糞肥，達到了13.66 g/kg，各處理差異顯著。全磷含量除花生殼粉外，各載體含磷量均高于對照泥炭。全鉀含量最高的為泥炭，達到9.07 g/kg。

2.2 不同載體對菌株生長的影響

載體不僅能夠為微生物的生長提供養分，而且對微生物的生長有一定影響，是微生物賴以生存的空間。良好的載體應當有利于微生物的生長繁殖，能夠有效地提高微生物在土壤以及植物根系中的存活率。由圖1可以看出，接種菌株djl-6和D-2后，本研究所使用的載體均表現出對供試菌株djl-6、D-2的生長無害，而且能夠促進供試菌株的生長，可以用作載體來制備djl-6、D-2菌劑。

2.3 不同載體的單一最大吸菌量

載體的單一吸菌量也是表征載體質量的一個標準，單一吸菌量指的是單位質量的載體所能吸附的最大活菌數。良好的載體需要有一個較大的吸菌量，從而能夠增加細胞的密度。各項載體的單一最大吸菌量如圖2所示，其中對于菌株djl-6來說，以泥炭作為吸附載體的處理最高，能夠達到2.30×1011cfu/g；以豬糞有機肥最低，僅為2.69×1010cfu/g。對于菌株D-2來說，也是以泥炭作為吸附載體的處理最高，能夠達到1.65×1011cfu/g；以豬糞有機肥最低，僅為2.39×1010cfu/g。

2.4 不同載體的有效菌數釋放率

載體的有效菌數釋放率也是一個表征菌劑質量的標準，在選擇微生物的載體時除了要考慮到其吸附能力之外，還必須測定其能夠釋放的有效活菌數，即真正能夠被釋放出來的活菌數。以djl-6作為菌劑接種微生物的載體的有效菌數釋放率如圖3所示，其中以蚯蚓糞肥為載體的有效菌數釋放率最高，達到了100.40%；而以秸稈肥作為載體的有效菌釋放率最低，僅為34.27%。以D-2作為菌劑接種微生物的載體的有效菌數釋放率與djl-6一致，即以蚯蚓糞肥為載體的有效菌數釋放率最高，達到了82.03%；以秸稈肥作為載體的有效菌數釋放率最低，僅為39.65%。

2.5 不同載體菌劑的活菌數變化

以djl-6、D-2為接種微生物的菌劑活菌數變化如圖4所示，隨著保存時間的延長，其中各項載體菌劑的活菌數均呈現下降狀態，以30 d時活菌數最多，因此，菌劑應在30 d內使用最為合適。以djl-6做接種微生物的菌劑保存30 d時活菌數大小為：泥炭>蚯蚓糞肥>花生殼粉>米糠>秸稈肥>雞糞肥>豬糞肥；保存120 d時，以蚯蚓糞肥作為載體的djl-6菌劑活菌數最高。以D-2作為接種微生物的菌劑保存30 d時活菌數大小為：泥炭>雞糞肥>花生殼粉>米糠>豬糞肥>蚯蚓糞肥>秸稈肥；保存120 d時，以豬糞肥作為載體的D-2菌劑活菌數最高。以兩種菌株做接種微生物的菌劑中均以花生殼粉活菌數下降最快，這是因為過高的含水量以及持水能力過大導致其在保存30 d時出現了雜菌污染。

2.6 不同載體菌劑的含水率變化

菌劑的含水率變化直接影響到接種微生物的存活，含水率過高和過低都不利于菌劑的保存。隨著時間的延長，各菌劑含水率整體都有下降。各載體菌劑保存120 d后的含水率變化如圖5所示，以菌株djl-6和D-2作為接種微生物的菌劑中均以泥炭作為載體的菌劑含水率最低，分別為13.34% 和13.60%；以米糠作為載體的菌劑含水率最高，分別高達25.69%和26.18%；以堆肥作為菌劑吸附載體的各個處理中，含水率均在20.00% 左右。

2.7 不同載體菌劑對土壤農藥殘留的降解

圖6為不同載體菌劑對土壤農藥殘留的降解。由圖可見，與對照相比，以djl-6為接種微生物的各載體菌劑中多菌靈含量均有不同程度的下降；3 d時，以施加泥炭菌劑的處理中多菌靈降解最快，其余菌劑處理降解較慢；10 d時，各處理以施加蚯蚓糞菌劑的降解率最高，在第10 天時的降解率可以達到94.30%，其降解效果優于泥炭以及其他堆肥載體。以D-2為接種微生物的各載體菌劑中啶蟲脒含量均有不同程度的下降；3 d時，以施加蚯蚓糞菌劑的處理中啶蟲脒降解最快；7 d時，各處理以施加蚯蚓糞菌劑的降解率最高，在第7 天時的降解率可以達到81.87%，其降解效果優于泥炭以及其他堆肥載體；第10 天時，各處理中啶蟲脒含量與對照相比均顯著下降，這可能與啶蟲脒的自然降解有關。

3 討論

作為評價菌劑質量的一個重要指標，載體的吸水率直接影響著接種微生物的生長[21-23]。載體需要為吸附在其上面的微生物的生長提供濕潤的生存環境才能使得微生物能夠在較長的一段時間生存，這也就意味著可以延長菌劑的保存時間。而本研究中所使用的載體除了雞糞肥之外，其余載體吸水率均處于60%以上，能為接種微生物的生長提供充足的水分。微生物接種材料含水率過低不能供應微生物的日常生存需求，而含水率過高會導致載體菌劑在保存時期菌劑的質量發生變化，產生霉菌，危及接種菌株的生存。本文所研究的各個載體自然狀態下風干3 d后的含水率在7.09% ~ 16.70%，滿足制作菌劑的所需的載體含水率標準[24]。pH也是一個影響微生物在載體中生存的因素，pH為中性的條件下適合微生物在載體中的生長繁殖，當pH低于5時，微生物生長受到明顯的抑制[25-26]。然而不同的細菌，其最適的生長pH也不相同。本研究所使用的兩株農藥降解菌其最適生長的pH范圍為6 ~ 8，而本研究所使用的大多載體的pH也介于6 ~ 8，可以滿足細菌生長的條件。對于不同載體養分情況的測定，發現豬糞肥、雞糞肥等有機肥中氮磷等元素含量較高。后續研究發現以豬糞肥、雞糞肥等有機肥作為載體時固體菌劑的有效菌數釋放率與活菌數較高，這可能與降解菌株更好地利用氮磷等營養元素生長有關。

當前，人們對于固體菌劑質量評估的標準主要是以活菌數作為一個重要指標，卻極少報道固體菌劑的有效菌數釋放率，然而后者卻是真正能夠反映接種菌劑應用效果的一個指標。本研究表明，同種菌的有效菌數釋放率隨著不同的載體改變而變化，同種載體接種不同的微生物，其有效菌數釋放率也不同，這與牛彥波等[27]的研究結果一致。載體的有效菌數釋放率過低可能是因為外源接種的微生物對載體需要有一個不同時間的適應過程，也可能是因為載體中內部微孔結構中可利用的有效營養物質太少而導致微生物大量死亡。而本研究中以djl-6作為接種微生物的載體菌劑中，以蚯蚓糞有效菌數釋放率最高，達到了100.40%，這是因為接種djl-6到蚯蚓糞后，djl-6在其中進行了大量的增殖。而以D-2作為接種微生物的載體菌劑中，也是以蚯蚓糞有效菌數釋放率最高，達到了82.03%。

固體菌劑的活菌數是載體菌劑評價的主要指標[28]。本試驗通過稀釋涂布平板法計算各菌劑的活菌數，結果表明，各菌劑活菌數均隨時間的延長而下降。固體菌劑最適保藏期在30 d內，而如若保存時間太長，也會出現污染。因此，有必要根據不同的載體進行不同的滅菌處理來提高菌劑活菌數。微生物的生長，除了要保證其所需的營養物質、礦質元素之外，還需要保證氧含量以及生長的濕度。本研究表明，各載體菌劑的含水率均隨時間延長而下降，這可能是菌劑中活菌數下降的主要原因。但過高的含水率又會導致菌劑的污染，比如以花生殼粉作為吸附載體的固體菌劑在30 d左右外觀開始變黑且出現雜菌。目前的研究中關于固體菌劑保存過程中含水率動態變化的研究極少，因此有必要通過調節固體菌劑在保存過程中的含水率來調控菌劑的活菌數。

不同的載體菌劑其降解農藥的速度也并不相同，固體菌劑加入到土壤中后，其降解速度相對較慢，這是因為接種微生物從載體中釋放到土壤中需要一個適應過程。兩種菌劑均以蚯蚓糞作為載體的菌劑降解效果最好，其中以djl-6作為接種微生物的蚯蚓糞能夠在10 d內降解土壤中90% 以上的濃度為5 mg/kg干土的多菌靈，以D-2作為接種微生物的蚯蚓糞能夠在7 d內降解土壤中80% 以上的濃度為10 mg/kg干土的啶蟲脒。

4 結論

以蚯蚓糞肥作為載體時，菌株djl-6、D-2有效菌數釋放率最高，分別達到了100.40% 和82.03%。以蚯蚓糞為載體的djl-6菌劑以及D-2菌劑在保存120 d時，活菌數均能維持在108cfu/g。以蚯蚓糞為載體的djl-6菌劑以及D-2菌劑在保存30 d后仍能有效降解土壤中的多菌靈及啶蟲脒農藥殘留。菌劑在保存30 d時，雖然以泥炭為載體的菌劑活菌數最高，但是泥炭作為一種不可再生資源，其價格偏高且再生速度慢，因此可將以蚯蚓糞為載體的菌劑進行大規模應用。